核酸杂交技术.ppt
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1、核酸分子杂交技术与应用,一、杂交的基本原理,杂交的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待测样品中的病毒核酸,杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号, 则说明样品中存在病毒核酸,进而证明病毒感染的存在。,一、核酸分子杂交的基本原理与分类(一)核酸分子杂交的基本原理1、变性(denaturation)(1)定义: 在一定的条件下,双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。,(2).引起核酸变性的因素,酸 碱,热,变性剂 (尿素),有机溶剂 (乙醇),(3)、变性核酸的特点: 粘度下降 沉降速度增加 浮力上升 紫外吸收增加,
2、2、融解温度:定义:在DNA热变性时,其A260的升高达最 大值一半时的温度。,影响Tm的因素: (1) DNA碱基的组成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低,(2)溶液的离子强度 低离子强度 Tm值越低 高离子强度 Tm值越高,(3)pH值 pH值5-9 Tm值变化不明显 pH11 不利于氢键形成(4)变性剂 干扰碱基堆积力和氢键的形成,3、复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素: DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度,4、杂交,定义 两条来源不同,但具有 互补序列的核酸,按碱基配 对原则复性形成一个
3、杂交体, 这个过程即杂交,或称分子 杂交。,分类DNA-DNADNA-RNARNA-RNA,二、核酸探针(一)探针的概念 探针(probe) 指能与特定靶分子发生特异性相互作用,并能被特殊方法所检测的分子。 例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交,杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记(同位素或非同位素标记)的核苷酸链。,(二)探针种类和选择1.探针种类(1)基因组DNA探针 为某一基因的全部或部分序列,或某一非编码序列。(2)cDNA探针 以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。 (3)RNA探针
4、以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率,但易于降解和标记方法复杂。(4)寡核苷酸探针,2.探针的选择 高度特异性,一般探针越长,杂交作用越强,其专一性也越强。,三、探针标记原理与方法 理想的探针标记物应具备高度的敏感性 标记物与探针结合后,不影响杂交时碱基 配对及探针分子的主要理化性质;检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳 性绿低外,尚需考虑环境污染少,价格低;若用酶促方法标记,应对酶的Km值影响不 大,以保证标记反应的效率和标记产物的 比活性。,(一)、标记物 放射性同位素标记物 非放射同位素标记物,1.放射性同位特点: 放射自显影技术检测,信号的强弱通过 计数银粒的多
5、少易于进行定量分析。主要缺点 射线对人体有伤害 放射性物质需特殊的处理 半衰期短不宜存放使用,2. 非放射性标记物 常用的有地高辛(digoxigenin,Dig)、生物素(biotin)、荧光素。特点: 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备 不存在放射性污染,(二)放射性同位素标记法探针标记法 酶反应法 化学反应法常用标记探针的同位素 32P 3H 35S 131I 125I 14C,全程标记1、随机引物法(random priming) 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。 将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火,使
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