RNA干扰对肾癌细胞端粒酶活性及增殖凋亡的影响.doc
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1、RNA干扰对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响 作者:郝林,郑骏年,李望,杨文发,刘俊杰,温儒民,陈家存,孙晓青【摘要】 目的 探讨针对人端粒酶RNA(hTR)及其催化亚基(hTERT)的小干扰RNA(siRNA)对肾癌细胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影响。方法 将hTRsiRNA、hTERTsiRNA(100nmol/L)单独或联合转染人肾癌7860细胞,采用RTPCR法检测hTR、hTERT mRNA表达,TRAPELISA法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖,免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果 (1)hTRsiRNA可显著降低7860细胞hTR mRNA表达(P<0.
2、01),hTERTsiRNA可显著降低hTERT mRNA表达(P<0.01),但彼此互不影响。(2)二者均能显著抑制端粒酶活性(P<0.01,P<0.01),并增加7860细胞增殖抑制率及凋亡细胞阳性率 (P<0.01,P<0.01)。二者联合应用与单独应用差异亦无显著性(P>0.05)。结论 hTR、hTERT siRNA通过抑制各自基因表达,抑制人肾癌细胞端粒酶活性,进而抑制增殖、促进凋亡。 【关键词】 肾癌;小干扰RNA;端粒酶RNA;端粒酶逆转录酶of Proliferation and Induct
3、ion of ApoptosisKey words:Renal neoplasm;Small interfering RNA; Human telomerase RNA;Human telomerase reverse transcriptase0 引言 端粒酶被激活导致肿瘤细胞无限增殖,抑制端粒酶活性能使肿瘤细胞无法合成端粒而凋亡,因此是肿瘤治疗的理想靶点1。端粒酶主要由端粒酶RNA(hTR)及端粒酶逆转录酶(hTERT)组成。端粒酶以hTR为模板合成端粒DNA,hTERT则是催化这一反应的唯一限速酶。RNA干扰能特异、高效阻抑靶基因表达,有望成为肿瘤基因治疗的有力工具。我们应用RNA干扰技
4、术阻抑hTR、hTERT表达,观察其对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响。1材料与方法1.1材料 人肾癌透明细胞株7860由本室保存。hTRsiRNA、hTERTsiRNA、阴性对照siRNA、siRNA转染试剂盒为美国Ambion公司产品。总RNA提取试剂盒、RTPCR试剂盒为美国Promega公司产品。TRAPELISA端粒酶活性检测试剂盒购自Roche公司。原位末端凋亡检测试剂盒购自Santa Cruz公司。1.2方法1.2.1siRNA的设计、合成 由Ambition公司设计、合成针对人端粒酶hTR序列及hTERT基因显性失活突变体区(NM003219,碱基序列位置21822200)
5、的siRNA。hTR序列如下:正义链: 5'UUGUCUAACCCUAACUGAGtt 3',反义链3'ttAACAGAUUGGGAUUGACUC5'。hTERT序列如下:正义链5'CAAGGUGGAUGUGACGGGCtt3'.反义链3'ttGUUCCACCUACACUGCCCG5'。经基因库检索确认与hTR、hTERT以外的基因序列无同源性。1.2.2细胞培养及转染 7860细胞于含10%FCS的RPMI1640中常规培养48h,按转染试剂盒说明将hTRsiRNA、hTERTsiRNA调整到终浓度为100 nmol/L,单独或
6、联合加入培养细胞内,另以生理盐水(空白对照)、脂质体、阴性对照siRNA作对照。培养24h后检测hTR/hTERT mRNA表达及端粒酶活性,72h后检测细胞增殖及凋亡。1.2.3RTPCR 提取总RNA,RTPCR试剂盒一步法行RTPCR反应。hTR上、下游引物序列如下:5'CTGGGAGGGGTGGTGGCCATTT3', 5'CGAACGGGCCAGCAGCTGACAT3'。hTERT引物:5'GCCAGAACGTTCCGCAGAGAAAA3',5'AATCATCCACCAAACGCAGGAGC3'。以GADPH基因作为内参
7、照。取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳,紫外照相并扫描分析,以hTR、hTERT/GADPH表达水平行半定量分析。1.2.4端粒酶活性的测定 采用端粒重复序列扩增酶联免疫吸附(TRAPELISA) 法进行检测,根据A=A450A690计算端粒酶活性,并计算与空白对照组比值。具体步骤按说明书进行。1.2.5MTT法检测细胞增殖 处理后7860细胞加入MTT10l/孔(5mg/ml),继续培养4h后吸弃上清。加入二甲亚砜100l/孔,溶解甲瓒紫结晶,酶标仪570nm波长处测定吸光度A值,计算抑制率。1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡 7860细胞于玻片上固定,洗片后与Triton100共同孵育2mi
8、n,滴加TUNEL反应混合液,在湿盒中37孵化1h,PBS洗3次,二氨基联苯染色,洗片后封片。高倍镜下随机计数5个视野,细胞核呈黄褐色即为阳性,计算阳性细胞百分比。2结果2.1siRNA对7860细胞hTR、hTERT mRNA表达的影响 与阴性siRNA对照组比较,hTRsiRNA组hTR mRNA水平明显下调(P0.01),hTERT mRNA水平无明显变化(P>0.05)。hTERTsiRNA组hTERT mRNA水平明显下调(P0.01),hTR mRNA水平无明显变化(P>0.05),见表1。表1 hTRsiRNA、hTERTsiRNA对肾癌7860细胞h
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