实时荧光定量PCR检测大肠癌腹腔微转移及其临床意义.doc
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1、实时荧光定量PCR检测大肠癌腹腔微转移及其临床意义 作者:钱俊 郑树 中西速夫 光幸秀 平井孝 加藤知行【摘要】 目的 应用实时荧光定量PCR技术检测大肠癌腹腔内游离癌细胞并探讨其临床意义。方法 2003年5月至2004年1月,收集在日本爱知癌症中心手术81例大肠癌病例的腹腔冲洗液,每个样本的cDNA均应用两种引物合成(随机引物和寡核苷酸引物),并在罗氏实时荧光定量PCR(LightCycler)上进行定量分析。每个样本同时进行常规细胞学检查。所有病例术后经过平均为1年的随访。结果 CEA mRNA 和CK-20 mRNA的阳性率和阳性值均与肿瘤的浸润深度(T)、分期以及淋巴结转移相关。在一个
2、合理界定值上,CEA 和CK-20检测的敏感度与特异度均为100%,而常规的细胞学检查则为33%和100%。结论 CEA 和CK-20 mRNA定量分析是检测大肠癌腹腔微转移的敏感和特异的方法,CEA 和CK-20 mRNA水平的异常与术后的无瘤生存率显著相关。 【关键词】 大肠肿瘤 癌胚抗原 细胞角蛋白20 实时荧光定量RT-PCR Quantitative Detection of Disseminated Cancer Cells in Peritoneal Washes with Real-Time RT-PCR for Patients with Colorectal Carcino
3、ma and Its Clinical Significance Abstract: Purpose To detect the free cancer cells in peritoneal cavity in patients with colorectal cancer by quantitative real-time RT-PCR method and investigate its clinical significance. Methods From May 2003 to Jan. 2004, peritoneal wash was obtained from 81 cases
4、 with colorectal cancer in Aichi cancer center. cDNA was synthesized from mRNA extracted from peritoneal washes by 2 kinds of primers (random primer and oligo primer). Quantification of CEA and CK-20 mRNA was performed on a LightCycler instrument with hybridization probe. A part of each peritoneal w
5、ash was also examined by conventional cytology. All patients were followed up with an average period of 12 months. Results Both CEA mRNA and CK-20 mRNA positive rates and values were significantly correlated with depth of tumor invasion, staging, lymph node metastasis. Sensitivity and specificity of
6、 CEA and CK-20 real-time RT-PCR with an appropriate cutoff value were all 100%, whereas those of conventional cytology were 33%, and 100%, respectively. Conclusion Both CEA and CK-20 mRNA quantifications are sensitive and specific methods for detecting micrometastasis in the peritoneal washes with c
7、olorectal cancer. Abnormality of CEA and CK-20 mRNA in peritoneal washes is correlated with disease free survival for colorectal cancer. Key words: colorectal neoplasms; carcinoembryonic antigen; cytokeratin-20; real-time RT-PCR 大肠癌为常见多发的消化道恶性肿瘤,随着生活水平的提高和饮食习惯的改变,大肠癌的人群患病率有所上升,并有年轻化趋势。目前,大肠癌病人尽管接受了以
8、手术为主的根治术,但临床上仍有50的大肠癌患者死于术后的肿瘤局部复发和转移,成为手术治疗失败的主要原因1,2。因此,应用先进的分子生物学技术、建立定量荧光RT-PCR方法检测大肠癌肿瘤标志物、术后转移的早期诊断受到高度重视。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是大肠癌细胞去分化过程中表达的一个重要标志,是最有价值的肿瘤标志物之一。细胞角蛋白20(cytokeratin-20,CK-20)是上皮细胞骨架的组成成分,表达于正常上皮及上皮源性原发肿瘤及其转移肿瘤细胞。CK-20表达范围严格,它仅局限在胃肠上皮细胞,且在侵袭、转移、扩散到其他组织器官时,始终保持稳定。胃
9、肠道检测细胞角蛋白20(CK-20)mRNA(CK-20 mRNA)可作为大肠癌患者血及骨髓转移的重要标志物。本研究应用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参因子3,检测大肠癌病人手术腹腔冲洗液中游离细胞的CEA mRNA和CK-20 mRNA,结合术后对病人随访,研究结果将为正确诊断肿瘤浸润程度和复发可能性,对大肠癌术后转移的早期诊断有重要意义,同时为肿瘤病人术后放疗、化疗方案的确定提供参考依据。 1 材料与方法 11 细胞株 人结肠癌肝转移表达CEA中分化腺癌细胞株,由日本爱知癌症中心癌症研究所肿瘤病理实验室建立,并培养于加入1
10、0%小牛血清(GIBCO BRL, Gaithersburg),100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的DMEM培养基(Nissui Pharmaceutical,Tokyo,Japan)中。 12 病例收集 收集从2003年5月至2004年6月在爱知癌症中心手术的81例大肠癌病例,其中包括39例结肠癌,40例直肠癌,以及2例结直肠双发癌。病例分期根据2001版UICC分期:2例0期,3例期,34例期,31例期,11例期。 13 腹腔冲洗液收集和保存 手术开始进腹后,立刻分别用100ml生理盐水冲洗盆底和膈下,轻微搅拌后回收冲洗液。离心(1 800r/min,5min),PBS重新冲洗游离
11、细胞沉淀,溶解于Isogen溶液中(Nippon Gene,Tokyo,Japan),-80保存至使用。其中一部分冲洗液同时做常规Papnicolaou染色,以进行细胞学检查。 1.4 RT-PCR检测 应用随机引物和寡核苷酸引物检测腹腔冲洗液游离细胞CEA mRNA,CK-20 mRNA 和GAPDH mRNA,经细胞总RNA提取cDNA合成实时荧光定量RT-PCR步骤。寡核苷酸引物为:CEA引物: 5-AACTTCTCCTGGTCTCTCAGCT,5-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAG;荧光探针:5-TGAAATGAAGAAACTACACCAGG,5-CTGCTATATCAGAGC
12、AA- CCCCAA;CK-20引物:5-CAGACACACGGTGAACTATGG,5-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG;荧光探针:5-AGACGGTCATTTAGGTTCTGCAT,5-GCCATTTTCTCATTGCCAACA;GAPDH引物:5-TGAACGGGAAGCTCACTGG,5-TCCACCACCCTGT- TGCTGTA;荧光探针:5-TCAACAGCGACACCCACTCCT,5-CACCTTTGACGCTGGGGCT。 PCR 的扩增使用Roche的LightCycler扩增仪,总反应体积为10l包括:Taq DNA聚合酶,dNTP混合物和缓冲(LightC
13、ycler DNA Master hybridization probes,Roche),4.0mM MgCl2,0.25M引物D和E,0.4M的探针,1l的模板cDNA,于Roche的毛细管中。95(10s)变性,5055(10s)淬火,72(10s)延伸,共50次循环,每次试验包括6个外对照管,1个阴性对照管,和未知浓度病人样品管。mRNA的定量可在LightCycler上与标准曲线对照后由软件自动计算得出。 1.5 统计分析 根据肿瘤浸润深度(T)、肿瘤分期、淋巴结转移,应用卡方检验进行组间CEA mRNA 值以及CK-20 mRNA值差异性分析。无瘤生存率用Kaplan-Meier方法
14、计算。 1.6 术后随访 所有病例均入全日本大肠癌病例库并按照爱知癌症中心术后随访程序随访,无失访。随访截至日期到2005年12月31日。 2 结 果 1 常规细胞学检查 所有81例病例均做常规病理学检查,只有1例(1.2%)诊断为阳性。Papnicolou 染色5级。其他71例1级,8例2级,1例3级。 2 大肠癌腹腔冲洗液中CEA水平 21 利用随机引物合成CEA cDNA 由于每个样本,都是用两种不同的引物(随机引物和寡核苷酸引物)来合成cDNA,故可以得到两个不同的实时荧光定量PCR的结果。CEA mRNA(利用随机引物合成)在4个黏膜层和黏膜下层的早期癌中均未能检出。根据以往在爱知癌
15、症研究所的研究结果,将界定值定在1.0。大于1.0定为阳性,小于1.0定为阴性。从盆底和膈下收集的标本只要有一处CEA mRNA值为阳性,该病例定为阳性。 应用实时荧光定量PCR,共检测了81例腹腔冲洗液标本,在pTis-1、pT2、pT3和pT4各组病例中,阳性率分别为0、0、10.9%、30%(P<0.05),各组病例的平均值分别为:0、0、31.2、12.8,T4病例较低的CEA mRNA值也反映了细胞学检查的结果(0)。CEA mRNA平均值在淋巴结转移阴性,淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为5%(2/40),17.1%(7/41)(P<0.05),CEA m
16、RNA平均值为8.03,31.05(P<0.01)。CEA mRNA在、期各组病例中,阳性率分别为0、3%、9.6%、44.44%(P<0.05),各组病例的平均值分别为:0、1.16、10.33、112.33(P<0.01)。腹腔转移阳性病例的CEA mRNA平均值(451.95)显著高于腹腔转移阴性病例(6.32)(P<0.01)。 .2 利用寡核苷酸引物合成CEA cDNA 在pTis-1、pT2、pT3和pT4病例中,阳性率分别为0、18.2%(2/11)、41.8%(29/55)、80%(8/10)(P<0.01)
17、,各组病例的平均值分别为:0,45.87,797.08,1163.89(P<0.01)。结果与用随机引物合成的CEA cDNA结果相一致。 CEA mRNA与肿瘤分期:在、期各组病例中,阳性率分别为0、35.29%(12/34)、70.96%(22/31)、54.54%(6/11),各组病例的平均值分别为:0、25.38、367.55、3 022.78(P<0.01)。CEA mRNA平均值与淋巴结转移:CEA mRNA平均值在淋巴结转移阴性、淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为 32.5%(13/40)、63.4%(26/41)(P<0.05),平均值为
18、63.62、1 047.88(P<0.01)。腹腔转移阳性病例的CEA mRNA平均值(10 328.3)显著高于腹腔转移阴性病例(61.8)(P<0.01)。 .2.3 常规细胞学和实时荧光定量PCR检测 3例有腹膜转移阳性的病例在镜下均诊断为pT3,其中只有1例常规细胞学检查结果为阳性(敏感度为33%)。而实时荧光定量PCR结果均为阳性(敏感度为100%)。 23 大肠癌腹腔冲洗液中RT-PCR检测CK-20水平(阳性参考值为0.1) 2.3.1 利用随机引物合成CK-20 cDNA 在pTis-1、pT2、pT3和pT4各组病例中,阳性率分别为0、0(0/11
19、)、14.5%(8/55)、40%(4/10)(P<0.05),各组病例的平均值分别为:0、0、31.3、12.9,T4病例较低的CEA mRNA值也反映了细胞学检查的结果(0)。 CK-20 mRNA与肿瘤分期关系:在、期各组病例中,阳性率分别为0、3.0%(1/34)、16.1(5/31)、54.5%(6/11)(P<0.01),各组病例的平均值分别为:0、1.10、4.49、501.96(P<0.01)。 CK-20 mRNA平均值与淋巴结转移:CK-20 mRNA平均值在淋巴结转移阴性,淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为 7.5%(3/40)、1
20、9.5%(8/41)(P<0.01),平均值为6.10、133.03(P<0.01)。腹腔转移阳性病例的CK-20 mRNA平均值(1 798.20)显著高于腹腔转移阴性病例(7.30)(P<0.01)。 2.3.2 利用寡核苷酸引物合成CK-20 cDNA 在pTis-1、pT2、pT3和pT4各组病例中,阳性率分别为0、0、25.45%(14/55)、70%(7/10)(P<0.05),各组病例的平均值分别为:0、0、1 160.7、40.0。T4病例较低的CEA mRNA值也反映了细胞学检查的结果(0)。 CK-20 mRNA与肿瘤
21、分期:在、期各组病例中,阳性率分别为0、17.64%(6/34)、32.25%(10/31)、45.5%(5/11)(P<0.01),各组病例的平均值分别为:0、3.01、14.36、8 284.63(P<0.01)。 CK-20 mRNA平均值与淋巴结转移:CK-20 mRNA平均值在淋巴结转移阴性,淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为 22.5%(9/40)、29.3%(12/41)(P<0.05),平均值为29.63、2 208.64(P<0.01)。腹腔转移阳性病例的CK-20 mRNA平均值(28 658.63)显著高于腹腔转移阴性
22、病例(73.89)(P<0.01)。 应用随机引物和寡核苷酸引物检测腹腔冲洗液游离癌细胞CEA mRNA与CK-20 mRNA实时RT-PCR结果比较见表1。 2.4 随访结果 随访时间平均为12个月(620个月),共有7例患者出现复发和转移,其中包括腹腔内播散2例,肝转移3例,肺转移2例。所有7例患者均为CEA或者CK-20阳性,复发转移率为17.5%(7/40)(剔除3例阳性对照)。其中有3例患者CEA和CK-20阳性均为阳性(3/9,33.3%)。其中有1例,手术时未发现腹膜转移,但CEA和CK-20均为阳性,3个月后再手术行肝转移灶切除术时,探查确认腹膜转移。CEA或者C
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- 实时 荧光 定量 PCR 检测 肠癌 腹腔 转移 及其 临床意义
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