16SrRNA基因序列分析法鉴定病原细菌 精灵论文.doc
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1、16SrRNA 基因序列分析法鉴定病原细菌朱飞舟1,陈利玉2,田奇3,谈成3,欧阳方丹1,陈汉春1,吴正理1(1. 中南大学生物科学与技术学院生物化学系,长沙 410013;2. 中南大学湘雅医学院微生物学系,长沙 410078;3. 中南大学生物科学与技术学院,长沙 410013)摘要:目的 运用 16S rRNA 基因序列分析法鉴定 14 种临床上常见的病原细菌,为该方法的 临床应用奠定基础。方法 提取病原细菌的 DNA,采用通用引物经 PCR 扩增 16S rRNA 基因片 段,再测序扩增片段。将测序结果用 Blastn 在线软件在 Nucleotide 数据库中进行同源性比对,根据序列
2、同源性鉴定病原细菌。结果 12 种病原细菌可以鉴定到“种”,2 种病原细菌可以鉴定到“属”。结论 16S rRNA 基因序列分析是一种有用的病原细菌鉴定方法。关键词:病原细菌;16S rRNA;基因序列分析中图分类号:R3Identification of Pathogenic Microorganisms by Sequencing 16S rRNA GeneZhu Feizhou1, Chen Liyu2, Tian Qi3, Tan Cheng3, OuYang Fangdan1,Chen Hanchun1, Wu Zhengli1(1. Department of Biochemist
3、ry, School of Biological Science and Technology, Central SouthUniversity, ChangSha 410013;2. Department of Microbiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, ChangSha 410078;3. School of Biological Science and Technology, Central South University, ChangSha 410013)Abstract: Objective
4、 To identify 14 kinds of common pathogenic microorganisms by sequencing 16S rRNA gene for establishing the basis of clinical use of this method. Methods DNA samples of the pathogenic microorganisms were extracted. The 16S rRNA genes were amplified by PCR and sequenced with the common primers. The se
5、quences of the 16S rRNA genes were aligned by using online software Blastn in Nucleotide database. The pathogenic microorganisms were identified according to the homology of their 16S rRNA genes. Results 12 kinds of pathogenic microorganisms could be identified to species. 2 kinds of pathogenic micr
6、oorganisms could be identified to genus. Conclusions 16S rRNA gene sequence analysis has been demonstrated a useful method for identifying pathogenic microorganisms.Keywords:16S rRNA; pathogenic microorganism; gene sequence analysis病原细菌的鉴定是临床细菌学的一项基本工作。鉴定病原细菌有多种方法,如形态学观 察、血清分型、生化分析、遗传学分析等。遗传学分析法有基因序
7、列分析、分子标记检测、 核酸分子杂交等1。遗传学分析的候选基因主要有 16S rRNA、23S rRNA、16-23S rRNA 间 隔区、gyrB(DNA 促旋酶 B)、rpoB(RNA 聚合酶的亚基)、sod(超氧化物歧化酶)基 因等1,2,3,应用最多的是 16S rRNA 基因。分子标记法包括 RAPD(random amplified polymorphic DNA, 随机扩增多态性 DNA ) , AFLP ( amplified fragment lengt h polymorphis m, 扩增片段长度多 态性), REP-PCR (REP 全称为 repetitive ext
8、ragenic palindromics, 重复基因外回文序列)1,4。目前,临床上通常采用表型观察和生化分析鉴定病原细菌,较少采用遗传学分析法。本基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金资助新教师基金课题(项目编号 20090162120028);湖南省 科技计划(项目编号 2009SK3192)作者简介:朱飞舟,(1974-),男,讲师,主要研究方向:基因结构与功能通信联系人:吴正理,(1978-),男,讲师,主要研究方向:宏基因组学. E-mail: hundred_chenyahoo 研究运用 16S rRNA 基因序列分析法鉴定了 14 种临床上常见的病原细菌,旨在为临床病原 细菌的
9、遗传学鉴定奠定基础。1 材料与方法1.1 病原细菌病原细菌由中南大学基础医学院微生物学系提供,分别为大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志 贺菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆 菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和白色葡萄球菌。1.2 细菌基因组 DNA 提取 CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromi de, 十六烷基三甲基溴化铵)法提 取细菌基因组 DNA。接种菌株于 LB 液体培养基,37震荡培养过夜。次日,取 1.5ml 新鲜 培养物,12,000g 离心 2min。去上清液,加入 567 l
10、TE 缓冲液,震荡悬浮细菌。然后,加 入 30l 10%SDS 和 15l 20mg/ml 蛋白酶 K(格兰氏阳性菌需先加入 20l 10mg/ml 溶菌酶,37反应 15min 后再加入蛋白酶 K),混匀,于 37温育 1hr,其间多次颠倒混匀。如果溶 液变澄清,表明细菌裂解完全。随后,加入 100l 5mole/L NaCl 和 80l CTAB/NaCl 溶液(5g CTAB 溶于 100ml 0.5mole/L 的 NaCl 溶液中,加热至 65使之溶解,室温保存),混匀,65温育 10min。可见白色的蛋白质沉淀。然后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1), 混匀至乳浊状。1
11、2,000g 离心 5min,转上清液至一洁净试管,加入与上清液等体积的异丙醇, 轻轻混匀,直至产生絮状 DNA 沉淀。12,000g 离心 5min,去上清液,沉淀用 1ml 的 70%乙 醇洗涤。离心,弃乙醇,在洁净工作台中干燥沉淀。将沉淀溶于 50l TE 缓冲液,加入 1l RNase A(10mg/ml),4储存备用。1.2.2 丙酮快速提取法。取新鲜细菌悬液,加入等体积丙酮,置于沸水浴中煮沸 10min。 然后 12,000g 离心 2min,其上清液即为细菌 DNA 溶液,可以用作 PCR 扩增的模板。1.3 PCR 扩增 16S rRNA 片段选取通用引物 27F 和 1492
12、R 作为 16S rRNA 基因片段的扩增引物。正向引物 27F 的序列 为 5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3,反向引物 1492R 的序列为 5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3。建立 50l 的 PCR 反应体系:DNA 模板 1l,ddH2O l,10*PCR 缓冲液(+KCl) 5l,25mmole/L MgCl2 2l,10mmole/L dNTP 1l,20mole/L 27F 引物 1l,20mole/L 1492R 引物 1l,5U/l Taq DNA 聚合酶酶 l,覆盖 50l 矿物油防止蒸发。采 用 Biometra P
13、ersonal Cycler PCR 仪扩增,PCR 反应程序为 94变性 5min 后于 94变性45sec、55退火 45sec、72延伸 90sec,30 个循环后于 72延伸 7min。4储存备用。1.4 PCR 产物序列分析扩增的细菌 16S rRNA 基因的 PCR 产物具有高度特异性,测序前无需纯化即可直接测 序。测序引物为 27F 和 1492R 序列,正、反测序(北京诺赛基因组研究中心完成)。1.5 序列同源性比对和进化树构建取各病原细菌 16S rRNA 基因片段测序图的中间部分 1380bp 片段序列进行同源性分析。1.5.1 将序列导入美国 NCBI 网站( :/ nc
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