人教版选修一5.3血红蛋白的提取与分离(共43张PPT).pptx
《人教版选修一5.3血红蛋白的提取与分离(共43张PPT).pptx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《人教版选修一5.3血红蛋白的提取与分离(共43张PPT).pptx(43页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、5.3血红蛋白的提取与分离,1,不是所有牛奶都叫特仑苏,如何从混合物中提取、分离高纯度的蛋白质呢?,2,湖南郴州又现“大头娃娃”,一、基础知识,1、蛋白质提取与分离的依据,分子的形状和大小;电荷性质和多少;溶解度;吸附性质;对其他分子亲和力。,3,一、基础知识,琼脂糖凝胶,也称做分配色谱法,4,一、基础知识,2、凝胶色谱法,较短,较长,较快,较慢,先从凝胶柱洗脱出来,后从凝胶柱洗脱出来,凝胶外部,凝胶内部,5,一、基础知识,2、凝胶色谱法,6,一、基础知识,3、缓冲溶液洗脱液,问题1:什么是缓冲溶液?,在一定范围内,能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。,问题2:
2、缓冲溶液的作用是什么?,能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响,维持pH基本不变。,7,一、基础知识,3、缓冲溶液洗脱液,问题3:缓冲溶液如何配置?,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3,NaH2PO4/Na2HPO4等。,问题4:本实验选用的缓冲溶液是什么?,磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4),8,一、基础知识,4、电泳,9,一、基础知识,4、电泳,凝胶电泳原理示意图,10,一、基础知识,4、电泳,电泳类型:琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(可以加SDS)
3、,11,一、基础知识,4、电泳,12,二、实验操作,1.样品处理: 洗涤红细胞 释放血红蛋白 分离血红蛋白,2.粗分离: 透析,3.凝胶色谱纯化: 按分子量大小分离其他蛋白,4.纯度测定: SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度,13,二、实验操作,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团,此基团可携带一分子O2或一分子CO2,血红蛋白因含有血红素而呈红色。,14,二、实验操作,血红蛋白(90%),15,二、实验操作,低速,16,二、实验操作,洗涤红细胞,加蒸馏水至原血液体积,加入40%甲苯,磁力搅拌器充分搅拌,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,17,二、实验操作,分离过程,红细胞
4、混合液,18,二、实验操作,有机溶剂 无色透明的甲苯层(第1层),脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层(第2层),血红蛋白溶液 红色透明液体(第3层),红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物(第4层),19,二、实验操作,目的:去除样品中分子量较小的杂质。,20,样品的处理及粗分离,1.红细胞的洗涤,3.分离血红蛋白溶液,2.血红蛋白的释放,采集血液,(血红蛋白的)纯化,(血红蛋白的)纯度鉴定,方法:,方法:,凝胶色谱法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,生理盐水,蒸馏水、甲苯,柠檬酸钠,4.透析,缓冲液,21,(二)凝胶色谱操作,取长40厘米,内径1.6厘米的玻璃管,两端需用砂纸磨平。底塞的制作:打孔挖出凹穴安
5、装移液管头部覆盖尼龙网, 再用100目尼龙纱包好,插到玻璃管的一端。顶塞的制作:打孔安装玻璃管。组装:将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,1、凝胶色谱柱的制作(教材P67),注意: 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面,否则难以铺实尼龙网,还会导致液体残留,蛋白质分离不彻底。,22,2、凝胶色谱柱的装填(教材P68),凝胶的选择: 材料: 代表意义: 凝胶的前处理:,操作提示(教材P69): 为了加速凝胶膨胀,可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热,逐渐升温至接近沸腾,通常只需12 h。这种方法不但节约时间,而且可以除去凝胶中可能带有的微生物,排除胶内的空气。,交
6、联葡聚糖凝胶(G-75)。,G :凝胶的交联程度,膨胀程度及分离范围。75:凝胶的得水值,即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。,配置凝胶悬浮液:计算并称取一定量的凝胶,在蒸馏水或洗脱液中充分溶胀,配成凝胶悬浮液。,(二)凝胶色谱操作,23,2、凝胶色谱柱的装填(教材P68),凝胶色谱柱的装填: 将色谱柱装置固定在支架上。将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内,装填时轻轻敲动色谱柱,使凝胶填装均匀。注意色谱柱内不能有气泡存在。,洗涤平衡: 装填完毕后,立即用缓冲液洗脱瓶,在50cm高的操作压下,用300mL的20mmol/l的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分洗涤平衡12小时,使凝胶装填紧密。,(二)凝胶色谱
7、操作,24,2、凝胶色谱柱的装填,操作提示(教材P70) : 1.凝胶装填时尽量紧密,以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2.装填凝胶柱时不得有气泡存在。 3.不能发生洗脱液流干,露出凝胶颗粒的现象。,(二)凝胶色谱操作,原因:气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。,原因:如果不紧密,在色谱柱内会形成无效的空隙,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液的流动次序,影响分离的效果,25,3、样品的加入和洗脱(教材P68-P69),调节缓冲液面: 打开下端出口,使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口。,(二)凝胶色谱操作,26,3、样品的加入和洗脱(教材P68-P69),
8、滴加透析样品: 吸管吸1mL样品加到色谱柱的顶端,滴加样品时,吸管管口贴着管壁环绕移动加样,同时注意不要破坏凝胶面。,(二)凝胶色谱操作,样品渗入凝胶床: 加样后打开下端出口,使样品渗入凝胶床内,等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口。洗脱: 小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度,连接缓冲液洗脱瓶,打开下端出口进行洗脱。,27,3、样品的加入和洗脱(教材P68-P69),(二)凝胶色谱操作,操作提示: 1.不要触及并破坏凝胶面。 2.贴壁加样。 3.使吸管管口沿管壁环绕移动。,28,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每5ml收集一试管,连续收集。,操作提
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 人教版 选修 5.3 血红蛋白 提取 分离 43 PPT
链接地址:https://www.31doc.com/p-14982321.html