一种快速微量化测定蛋白质谷氨酰胺酶活性的方法及其初筛应用.doc
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1、一种快速微量化测定蛋白质谷氨酰胺酶活性的方法及其初筛应用收稿日期:2016-01-28 基金项目:国家自然科学基金(编号:31170920);大夏大学生科研基金项目(编号:2014DX-333)。 通信作者:黄静,博士,副教授,主要从事食品微生物研究。E-mail:。 ZK) 植物蛋白如大豆蛋白、小麦蛋白和玉米蛋白等在食品工业中应用非常广泛。但由于大部分植物蛋白在弱酸性环境中(大多数食品系统的pH范围)存在溶解性差、稳定性低的问题,造成其应用范围受到了限制1。采用蛋白质脱酰胺法对植物蛋白进行改性,增强其相关功能特性,扩大其在食品领域的应用是目前热门的研究方向1-3。蛋白质谷氨酰胺酶(prote
2、in-glutaminase,PG)是一种能够催化L-谷氨酰胺残基,生成L-谷氨酸和氨的酶,并且对于天冬酰胺残基以及游离的谷氨酰胺残基的酰胺键没有作用4,相比较于谷氨酰胺转氨酶以及肽谷氨酰胺酶具有无蛋白交联、无副作用等优点5。目前PG已应用到小麦蛋白、米谷蛋白、麦麸蛋白等多种蛋白的改性试验中,试验结果证明其可明显地增强蛋白质脱酰胺程度6。 2000年Yamaguchi等从解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)9670T中首次发现了PG7。由于产PG的菌株稀少,世界上对PG的研究主要为该酶的结构和应用8。近年来,华东师范大学微生物实验室致力于产PG菌种研究,
3、从全国各地土壤中一共筛选到9株产PG的细菌,经鉴定,其中7株为产吲哚金黄杆菌(C.indologenes),1株为解朊金黄杆菌(C.proteolyticum),1株为黏金黄杆菌(C.gleum),其酶活大小在0.100.72 U/mL之间,其中2013年从四川省土样中筛选分离到的1株能够产生PG的解朊金黄杆菌Y8-10-1,经鉴定与已被批准可用于食品工业生产的菌株9670T为同一来源菌株,两者酶活均为0.40 U/mL左右9,低酶活限制了其在工业生产中的大规模应用。 笔者实验室欲通过化学诱变、紫外诱变等传统育种方法,以Y8-10-1作为出发菌株得到高产PG菌株,但由于传统诱变方法操作复杂、筛
4、选样本量大,并且由于国际通用的测定PG酶活的苯酚-次氯酸盐方法10-11试管用量大、操作复杂、耗时长等缺点难以在初筛过程中大规模应用。因此,准确、快速微量化测定PG酶活方法的建立在高通量筛选高产蛋白质谷氨酰胺酶过程中有着重要的意义。 本试验基于苯酚-次氯酸盐方法,借助酶标仪快速检测功能,利用PG与底物反应过程中产生氨的显色反应最大速率maxv代替酶活,建立适合高通量筛选的96孔微孔板反应体系,30 min可检测60个以上的反应,完全达到高通量筛选的要求12,并与苯酚-次氯酸盐方法进行比较以验证该方法的可行性。 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1菌种产PG的解阮金黄杆菌Y8-10-1,由华
5、东师范大学微生物实验室保藏。 1.1.2培养基种子培养基(1 000 mL):10 g多聚蛋白胨,2 g 酵母提取物,1 g MgSO4?7H2O,加ddH2O至1 000 mL,调节pH值至7.0。发酵培养基(1 000 mL):5 g乳糖,10 g多聚蛋白胨,1.7 g NaH2PO4?H2O,0.25 g K2HPO4,0.25 g MgSO4?7H2O,0.05 g FeSO4?7H2O,加ddH2O至1 000 mL,调节pH值至7.2。 1.1.3试剂与仪器 主要试剂:176 mmol/L PBS (pH值为 6.5):(1)0.2 mol/L Na2HPO4溶液:称取 71.6
6、g Na2HPO4?12H2O,用ddH2O定容到1 000 mL;(2)0.2 mol/L NaH2PO4溶液:称取31.2 g NaH2PO4?2H2O,用ddH2O定容到 1 000 mL。取31.5 mL(1)溶液、68.5 mL(2)溶液,以及11364 mL ddH2O,混合均匀。 底物溶液(反应液):称取0.337 g二肽Cbz-Gln-Gly,用176 mmol/L PBS(pH值6.5)定容至100 mL。400 mmol/L CCl3COOH溶液(终止液):称取6.536 g CCl3COOH,用ddH2O定容至100 mL。显色剂A:称取 40.46 g 苯酚和0.15
7、g Na2Fe(CN)5NO2?H2O,用ddH2O定容至 1 000 mL。显色剂B:称取49.94 g KOH,用ddH2O定容至 1 000 mL。显色剂C:称取200.40 g K2CO3,加适量ddH2O溶解,待冷却后加8.33 mL NaClO溶液,ddH2O定容至 1 000 mL。醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为4.5):取18 g醋酸钠,加9.8 mL冰醋酸,再加水定容至1 000 mL。NIT母液:称取0.1 g NIT,溶于20 mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值为45)。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳:配制具有12%的分离胶和5%的浓缩胶,插10孔样品梳,胶厚1.5 mm。标准PG
8、样品(50 U/g),购自Amano公司;底物Cbz-Gln-Gly,购自Sigama公司;大豆蛋白胨、多聚蛋白胨生化纯,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;酵母提取物,购自安琪酵母股份有限公司;苯酚、硝普钠、亚硝酸钠(NIT)等常规试剂分析纯,购自上海润捷化学试剂公司。恒温调速回旋式摇床DKY-,购自上海杜科自动化设备有限公司;Synergy HT多功能酶标仪,购自BioTek公司,Labofuge 400R水平离心机,购自Thermo Scientific公司。 1.2试验方法 1.2.1苯酚-次氯酸盐法测定PG酶活试管法 参照国际通用的测定氨含量的苯酚次氯酸法10-11进行PG酶活测定
9、。 试验组:取100 L酶样品溶液加入试管中,向其中加入1 000 L已在37 水浴中预热10 min的底物Cbz-Gln-Gly溶液,混合液在37 恒温培养箱中温育30 min。然后加入1 000 L的400 mmol/L CCl3COOH溶液,终止反应。 对照组:取100 L酶样品溶液加入试管中,向其中加入1 000 L已在37 水浴中预热10 min的400 mmol/L CCl3COOH溶液,混合液在37 恒温培养箱中温育30 min。然后加入 1 000 L 的底物Cbz-Gln-Gly溶液,混合均匀。 从每支试管中吸取120 L溶液加入到新试管中,再加入480 L蒸馏水,混合均匀,
10、然后向试管中依次加入900 L显色剂A、450 L显色剂B和900 L显色剂C。混合均匀后置于37 恒温培养箱中温育20 min,在酶标仪630 nm下测定吸光度。 1个酶活单位定义为1 min催化底物生成1 mol氨需要的酶量,根据以下公式计算蛋白质谷氨酰胺酶活力。 JZ(HT9.,8.蛋白质谷氨酰胺酶活力=SX(试验组氨含量-对照组氨含量)SX(2.10.1SX)17.0330aSX)HT。JZ) 式中:蛋白质谷氨酰胺酶活力单位为U/mL;SX(2.10.1SX)为反应液与酶液的体积比;17.03为氨的相对分子质量;30为反应时间,min;a为氨标准曲线的斜率。 1.2.2基于苯酚-次氯酸
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- 一种 快速 微量 测定 蛋白质 谷氨酰胺 活性 方法 及其 应用
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