不同种类白条天牛基因条形码特征与系统发育初探.doc
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1、不同种类白条天牛基因条形码特征与系统发育初探收稿日期:2016-03-18 基金项目:江苏省出入境检验检疫局科技计划项目(编号:2014KJ48)。 ZK) 沟胫天牛亚科(Laniinae)隶属于鞘翅目(Cleoptera)天牛科(Cerambycidae),是天牛科种类数目最多的一个亚科,全世界已知种类大约20 000种。其中白条天牛属(Batocera)昆虫是该亚科内十分重要的一类林木害虫,它的幼虫钻蛀取食树木的树干及枝条的木质部、韧皮部,可危害柳树、苹果树、栎树、杨树等多个阔叶树种,给农林业生产造成极大的经济损失1-2。全世界白条天牛种类约有60种,广泛分布在非洲、澳大利亚、亚洲和东欧地
2、区。我国约有12种,包括锈斑白条天牛(B. numitor Newman)、麻栎白条天牛(B. quercinea Wang et Zhang)等2-3。除上述12种外,余下约50种在我国是没有分布的,被2007年发布的进境植物检疫性有害生物名录列为我国检疫性昆虫2。 近年来,随着我国外向型经济的持续发展,原木和木质包装进出口数量剧增,我国多个口岸在进境木材检疫查验中截获了白条天牛。例如,2009年乍浦口岸检疫人员从马来西亚进境原木中首次截获托氏白条天牛(B. thomsoni)4。2012年张家港口岸从巴布亚新几内亚原木中截获白条天牛B. laena5。另据相关媒体报道,2013年张家港口岸
3、从非洲原木中截获到白条天牛B. wyllei6。2014年,吴江口岸在进境原木中截获了婆罗白条天牛(B. tigris)7。 目前,昆虫种类鉴定以形态学鉴定为主,但可用于形态比较的特征数量有限且不稳定,同时国门口岸截获的昆虫往往是以卵、幼虫、蛹或肢体残缺虫态出现,传统的形态学鉴定方法显然不适用8;因此,需要探索新方法来解决传统形态学鉴定中遇到的困境。随着分子试验技术的迅猛发展,利用DNA序列研究遗传进化、系统发育及种类鉴定已经成为昆虫学研究的热点。其中,基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基(mtDNA CO)基因序列的DNA条形码技术是当前相对成熟的分子鉴定技术9。花婧等通过此技术对大小蠹属17个种
4、进行了分子鉴定10。Stauffer等利用该技术,实现了对欧洲7种齿小蠹的快速鉴定11。 本研究对已获得的6种白条天牛的COQX(Y15QX)基因片段进行测序和对比,分析这些COQX(Y15QX)序列(即DNA条形码)的特征及遗传系统发育关系,以获得能准确鉴定白条天牛种类的分子方法,为研究其他天牛种类的分子鉴定方法提供有益参考12。 1材料与方法 1.1昆虫标本 本试验所用的标本由南通出入境检验检疫局有害生物检疫实验室提供,包括锈斑白条天牛(B. davidis)、橙斑白条天牛(B. numitor)、印尼白条天牛(B. celebiana)3种白条天牛,所有天牛标本均经国内天牛专家安榆林研究
5、员鉴定。标本来源与采集时间如表1所示。另外,从GenBank网站获得4种白条天牛共7条COQX(Y15QX)序列(表2)用于比对。其中,印尼白条天牛(B. celebiana)是在我国没有分布的国外种类,余下3种天牛在我国均有分布。 1.2提取基因组DNA 采用从北京金麦格生物技术有限公司购买的GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒提取各样品的基因组DNA。提取方法:用双蒸水冲洗100%乙醇浸泡的天牛肌肉组织(应少于30 mg),转入1.5 mL离心管中,置于MM400球磨仪研磨30 s(30次/s)后,12 000 r/min离心 10 min。离心后加180 mL裂
6、解缓冲液及20 mL Proteinase K,于55 水中温浴10 min。再加200 mL无水乙醇、200 mL缓冲液、20 mL磁珠,用磁珠来吸附基因组DNA,然后加 500 mL Wash Buffer去?s。最后加20 L Elution Buffer,静置5 min后洗脱磁珠即得样品的基因组DNA溶液10,13。 1.3COQX(Y15QX)片段扩增和测序 在ProFlexTM PCR仪(购自ABI公司)上进行PCR反应。反应采用25 L体系,其中2 L MgCl2(25 mmol/L),2.5 L 10buffer,1 L dNTPs(2.5 mmol/L),0.4 L rTaq
7、 DNA聚合酶(5 U/L)(购自TaKaRa公司),上、下游引物(10 mol/L)(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)各0.5 L,加灭菌水至25 L。PCR条件:94 预变性5 min;94 变性40 s,55 退火30 s,72 保持1 min,设置35个循环;最后在 72 下延伸10 min。反应完毕将PCR产物送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序13-14。本试验PCR反应采用巢式PCR,第1轮反应引物为F1、R1,第2轮PCR引物为F2、R213,各引物序列如表3所示。本试验利用巢式PCR既降低了扩出多个非目标基因条带的可能性,也提高了PCR检测的准确度和灵敏度 1.4序列分析
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