二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究硕士学位.doc
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1、硕士学位论文 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载 体研究 A Novel Anticancer Drug Carrier System Based on Silica Nanoparticles by HAI Luo B.S. (Hunan University) 2007 A thesis submitted in partial satisfaction of the Requirements for the degree of Master of Science in Biochemistry and molecular biology in the Graduate School of
2、 Hunan University Supervisor Professor He Xiaoxiao Aptamer; Drug carrier; Silica nanoparticles (SiNP); Sodium fluoride (NaF); Doxorubicin (DOX); Pingyangmycine (PYM) 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 VI 目 录 学位论文版权使用授权书 .I 摘 要II ABSTRACTIV 第 1 章 绪论.1 1.1 抗肿瘤药物载体研究的重要性.1 1.1.1 癌症治疗的主要方法.1 1.1.2 抗肿瘤药物剂型研究的发展过程.2 1.
3、1.3 纳米抗肿瘤药物载体的发展3 1.2 纳米抗肿瘤药物载体及其应用.3 1.2.1 脂质体.3 1.2.2 壳聚糖.7 1.2.3 聚合物颗粒.9 1.2.4 二氧化硅纳米颗粒.13 1.3 本论文的构思.18 第 2 章 基于磷酸化修饰的二氧化硅纳米颗粒药物缓释载体研究.21 2.1 前言.21 2.2 实验部分.21 2.2.1 试剂和仪器.21 2.2.2 磷酸化修饰的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的制备.23 2.2.3 不同量磷酸硅烷化试剂制备的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的表征.23 2.2.4 不同量磷酸硅烷化试剂制备的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的平阳霉素 释放行为考察.23
4、 2.2.5 磷酸化修饰的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒性能考察.23 2.3 结果与讨论.24 2.3.1 不同量磷酸硅烷化试剂修饰的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的透射电 镜成像.24 2.3.2 不同量磷酸硅烷化试剂修饰的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的 电位.25 2.3.3 不同量磷酸硅烷化试剂修饰的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的平阳霉 素释放情况.26 2.3.4 30L 磷酸硅烷化试剂制备的包裹平阳霉素二氧化硅纳米颗粒的性能27 2.4 小结.28 第 3 章 基于氟化钠催化的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的制备研究.30 3.1 前言.30 硕士学位论文 VII 3.2 实验部分.30
5、3.2.1 试剂和仪器.30 3.2.2 氟化钠催化二氧化硅纳米颗粒的可行性研究.32 3.2.3 氟化钠/氨水催化合成的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的制备32 3.2.4 氟化钠/氨水催化合成的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的荧光性质表征32 3.2.5 不同功能基团修饰的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的制备.33 3.2.6 不同功能基团修饰的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒的性质考察.33 3.2.7 羧基化修饰的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒性质研究.34 3.3 结果与讨论.34 3.3.1 氟化钠催化二氧化硅纳米颗粒形成的可行性研究.34 3.3.2 阿霉素的包裹浓度的优化.37 3.3.3 不同功能
6、基团修饰的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒缓释性能的考察.38 3.3.4 羧基化修饰的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒性质研究.41 3.4 小结.43 第 4 章 修饰核酸适体的包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒用于肿瘤的靶向成像与治疗研究.44 4.1 前言.44 4.2 实验部分.44 4.2.1 试剂和仪器.44 4.2.2 药物载体羧基化二氧化硅纳米颗粒生物相容性考察.46 4.2.3 未修饰核酸适体的羧基化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒对肿瘤细胞杀伤 效果的评价.46 4.2.4 羧基化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒表面核酸适体的修饰.46 4.2.5 修饰核酸适体的羧基化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒对肿瘤细
7、胞特异性 识别效果的考察.47 4.2.6 修饰核酸适体的羧基化包裹阿霉素二氧化硅纳米颗粒对肿瘤细胞靶向杀 伤效果的评价.47 4.2.7 碘化丙啶染色检测细胞活性47 4.3 结果与讨论.48 4.3.1 药物载体毒性的考察.48 4.3.2 载药体系非特异性杀伤效果的细胞评价.48 4.3.3 核酸适体修饰的原理.49 4.3.4 核酸适体连接的二氧化硅纳米颗粒对细胞识别效果的考察.50 4.3.5 核酸适体连接的二氧化硅纳米颗粒对细胞毒性的考察.51 4.3.6 碘化丙啶染色检测细胞活性.52 4.4 小结.53 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 VIII 结 论.55 参考文献
8、.56 致 谢.65 硕士学位论文 IX 本文所用英文缩写词表 缩略词缩略词名称名称缩略词缩略词名称名称 APS N-(-氨乙基)-氨丙基三 乙氧基硅烷 PYM平阳霉素 CEM 人急性白血病 T 淋巴细 胞 PAMAM聚酰胺 COOH-SiNP 羧基化二氧化硅纳米颗 粒 PEG-DOX-SiNP 聚乙二醇包裹阿霉素二氧化 硅纳米颗粒 COOH-DOX-SiNP 羧基化包裹阿霉素二氧 化硅纳米颗粒 PO4-DOX-SiNP 磷酸化包裹阿霉素二氧化硅 纳米颗粒 DOX阿霉素PO4-PYM-SiNP 磷酸化包裹平阳霉素二氧化 硅纳米颗粒 EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙 基)-碳化二亚胺 RE
9、S网状内皮系统 FDA 美国食品药品监督管理 局 SiNP二氧化硅纳米颗粒 MES 2-甲氧基(聚乙二醇)- 丙基三甲氧基硅烷 Sgc8c-DOX-SiNP 核酸适体 Sgc8c 修饰的包裹 阿霉素二氧化硅纳米颗粒 MTS CellTiter 96AQueous 单 溶液细胞增殖检测试剂 盒 TEOS正硅酸乙酯 NH2-DOX-SiNP 氨基化包裹阿霉素二氧 化硅纳米颗粒 TEM透射电子显微镜 NHSN-羟基琥珀酰亚胺Triton X-100曲拉通 PI碘化丙啶THPMP 3-(三羟基硅基)丙基甲基磷酸 酯钠盐 PEG聚乙二醇TSEA N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二 胺-三乙酸钠 硕士学位论文
10、 1 第第 1 章章 绪论 1.1 抗肿瘤药物载体研究的重要性 近年来,随着全球经济的飞速发展,人类的生活习惯和行为模式发生了巨大的改 变,加之工农业发展过程带来的环境污染和人口老龄化等原因,目前癌症正在超过心 脑血管疾病而成为威胁人类安全的头号杀手1。近年来肿瘤的发病率日见增长, Stewart等2发布的世界癌症报告指出每年全世界大约新增癌症患者一千万例。2000年 世界恶性肿瘤(癌症)发病人数为1006万,死亡62l万,现患人数为224l万。发病率与死 亡率比10年前增长约22。2007年,有790万人死于癌症,约占全球死亡人数的13%。 预计2015年全世界将有900万人死于癌症,203
11、0年将有1200万人死于癌症。在所有癌症 的死亡病例中,有70发生在中等收入和低收入国家。因此癌症的控制是世界各国政 府的卫生战略重点,癌症的治疗成为世界所关注的研究课题。本章在简要介绍几种癌 症治疗手段的基础上,重点综述各种抗肿瘤药物载体的研究进展,并在此基础上提出 本论文拟开展的工作。 1.1.1 癌症治疗的主要方法 1.1.1.1 手术治疗 手术治疗是许多早、中期实体肿瘤最主要的有效治疗方法,约60的实体瘤以手 术作为主要治疗手段3。某些局限性肿瘤单用手术即可治愈,但手术也有它的局限性, 由于恶性肿瘤生长快,表面没有包膜,它和周围正常组织没有明显的界限,局部浸润 厉害,并可通过淋巴管转移
12、。因此,手术要把肿瘤及其周围一定范围的正常组织和可 能受侵犯的淋巴结彻底切除。故手术可造成一定程度的功能障碍,甚至残疾;对瘤周 围涉及重要器官及组织时,限制了手术切除肿瘤的彻底性;手术不能防止肿瘤复发和 转移等。因此手术仅适合于肿瘤范围较局限、没有远处转移、体质好的病人。 1.1.1.2 放射治疗 放射治疗简称放疗,它是利用高能电磁辐射线作用于病变部位,达到破坏癌细胞 目的的一种治疗方法。目前临床上应用的放射线有X线治疗和线治疗两种4。放射治 疗是一种有效的区域性治疗方法。早期的皮肤癌、霍奇金病、鼻咽癌、宫颈癌、喉癌 等单纯放疗也可以达到治愈。但同手术治疗一样,放疗对肿瘤的远处转移也无能为力。
13、 另外,由于放射抗拒、乏氧细胞以及重要器官和组织放射耐受性等因素的影响,放疗 的疗效也受到限制。因此,放射治疗对癌症是否有效,取决于许多因素,如临床时间 的早晚,肿瘤病理类型和它对放射的敏感性,病人的整体状况和肿瘤周围情况等。 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 2 1.1.1.3 化学治疗 化学治疗是应用一种或数种化学药物,通过口服或注射达到治疗肿瘤的方法。化 学治疗始于 20 世纪 40 年代氮芥治疗淋巴瘤。1965 年,顺铂(DDP)的发现是肿瘤化学 药物历史上的一个里程碑5。随后研发出的许多化疗新药及其临床研究,使肿瘤化疗疗 效得到了提高。化学治疗是目前治疗癌症的主要手段。化学疗
14、法是将药物经血管带到 全身,因为所用药物都是有害,甚至是带毒性的,体内细胞,无论是否为癌细胞,都 受到破坏。这极大地影响了化疗的治疗效果,对患者的身心造成了很大的伤害。提高 化疗效果的关键是如何提高药物的靶向性和降低药物的毒副作用。 1.1.2 抗肿瘤药物载体研究的发展过程 通过载体包裹抗肿瘤药物,能够减少体内酶对抗肿瘤药物的破坏与降解从而提高了 药物在体内的稳定性。同时包裹在载体内的抗肿瘤药物通过缓释过程能够在较长时间 内保持有效的血液浓度,延长药物的作用时间,提高抗肿瘤药物的利用率,降低药物 使用的频率。更为重要的是可以通过在抗肿瘤药物载体上修饰各类靶向分子实现药物 的靶向运输,降低药物的
15、毒副作用。 1.1.2.1 药物载体的发展进程 药物载体的发展可分为几个阶段6。20世纪70年代主要应用的是粒径为5m2mm 的微囊。80年代发展了许多粒径小得多的第二代产品,如110m的微粒。这种粒径的 载药微粒通过非胃肠道给药时,被器官或组织吸收能显著延长药效、降低毒性、提高 活性和生物利用度。90年代至今发展的第三代产品是粒径在10nm500nm的纳米药物载 体。 1.1.2.2 抗肿瘤药物的载体运输对肿瘤治疗带来的新契机 值得注意的是,以往花费巨大的人力、财力筛选成百上千的极有前途的新药落选, 仅仅是因为口服的活性低,注射的半衰期短,如果采用药物包裹技术,通过药物包裹 后采用非胃肠道缓
16、释给药。既不要求口服的活性,也不要求药物本身在体内有长的半 衰期,许多按过去标准认为不合格的落选药物,可能做成满意的新药7。 1.1.2.3 抗肿瘤药物载体产业的发展前景 纳米医药对药释系统已经产生了重大影响,制药公司目前已经意识到药释系统的 研究是他们研发过程中必不可少的一部分。根据一份市场报告(nanoMarket)测算, 到2012年,纳米技术将使药释系统产生48亿美元的收入。另外一份市场报告 (Nanotechnology Law Business)也指出,纳米技术能使药释系统市场的销售额从2005 年的12.5亿美元增至2010年的52.5亿美元,2015年会达到140亿美元。 硕士
17、学位论文 3 1.1.3 纳米抗肿瘤药物载体的优势 近年来纳米技术对药物研究领域的不断渗透和影响,引发了一场深远的革命,特 别是对药物新剂型的研究,由“微米技术”迅速全面地推进到“纳米技术”的深广度8。 运用纳米技术开发的药物克服了传统药物许多缺陷以及无法解决的问题。与传统药物 相比,纳米药物具有颗粒小、比表面积大、表面反应活性高、活性中心多、吸附能力强 等特性9,因此它有许多常规药物所不具有的优点:(1)载药纳米颗粒通过在外壳上 修饰抗体、核酸适体(Aptamer) 、叶酸等生物分子,制成“生物导弹”靶向输药至特 定器官;(2)纳米颗粒具有较为独特的控制释药模式,开始一般表现为相对的爆发释
18、放,其后在相当长的一段时间内表现为恒定释放,因此,纳米控释制剂可以显著延长 有效血药浓度时限,减少用药和给药次数,减轻毒副作用与患者痛苦,增加患者的依 从性;(3)由于载药纳米颗粒具有粘附性、粒径小,因此,可以延长局部用药药物在 局部组织或部位的滞留时间,增加药物的接触面积,提高口服药物的吸收和生物利用 率;(4)防止药物在输送过程中被体内的消化酶快速降解,提高药物在胃肠道中的稳 定性,提高药物利用率;(5)载药纳米颗粒可以改变膜转运机制,提高药物在生物膜 中的透过性,有利于药物透皮吸收并发挥在细胞内的药效;(6)利用纳米材料的某些 特殊性质还可制成新型的控释药物,如金纳米颗粒在特征光照射下产
19、生热效应,用于 制造热敏控释药物10,利用磁纳米颗粒的磁向导性,靶向病变部位进行热疗11;(7) 现有的抗肿瘤药物大多水溶性差,缺乏特异性,给药后血液浓度波动大,毒副作用较 大,这些都是影响肿瘤临床治疗效果的主要因素。利用纳米颗粒作为载体可对原药进 行改性,增强水溶性或获得靶向性和缓释功能,从而增强肿瘤的治疗效果和降低毒副 作用。 1.2 纳米抗肿瘤药物载体及其应用 理想的纳米药物载体材料应具备以下几方面的性质12:(1)与药物不发生化学反 应;(2)具有较高的载药量和包封率;(3)有适宜的制备及提纯方法;(4)载体材料 生物相容性好,且毒性较低;(5)有一定机械强度和稳定性,具有适当的粒径与
20、粒形; (6)具有较长的体内循环时间。目前,常用的纳米抗肿瘤药物载体主要有脂质体、壳 聚糖、聚合物纳米颗粒和二氧化硅纳米颗粒。 1.2.1 脂质体 1.2.1.1 脂质体的基本介绍 脂质体(liposomes)是一种天然存在或者可以人工制备的自组装胶状颗粒,最先 是20世纪60年代中期英国科学家Bangham和其学生将天然磷脂分散在水中采用电镜观 察时发现的。最初脂质体主要作为人工生物膜用于研究生物膜的结构和功能的关系, 基于二氧化硅纳米颗粒的抗肿瘤药物载体研究 4 20世纪70年代初期,Gregoriadis13首先提出用脂质体作为-半乳糖苷酶载体治疗糖原累 积疾病后,人们开始应用脂质体作为
21、药物载体控制药物释放,水溶性药物包裹与水相 中,而脂溶性药物包裹在脂质双分子层中。 本实验室的郑明彬等14利用脂质体将脂溶性的药物马卡包裹在纳米脂质体内,发 展了一种制备性质良好的马卡制剂的新方法。通过该法制备的马卡纳米制剂包封率高, 胶体溶液物理稳定性良好,冻干粉剂的水再分散性较好,制备过程马卡损失量少,产 物性质优良。李慧敏等15以大豆磷脂、聚乙交酯丙交酯(PLGA)和聚乙二醇(PEG) 三种原料成功制备了包裹难溶于水的植物提取物姜根油的纳米脂质体、PLGA纳米颗粒 和PEG纳米颗粒,并对三种不同载体制备的纳米制剂的形貌、大小、Zeta电位,包封率 及物理稳定性等进行了考察。为开发新型的难
22、溶药用植物提取物的理想药剂提供了实 验依据。胡建兵等16制备了一种TMP1 肽修饰的紫杉醇脂质体颗粒,对其靶向效果进 行了初步研究。其中TMP1 肽链能特异性的识别前列腺癌细胞。考察了这种修饰TMP1 肽的包裹紫杉醇脂质体颗粒的体外、体内的靶向药效。体外的细胞靶向结果说明修饰 TMP1 肽的紫杉醇脂质体颗粒对靶细胞前列腺癌细胞的杀伤明显增强。但是体内的结 果不是非常理想:修饰TMP1 肽的紫杉醇脂质体颗粒与未修饰TMP1 肽的紫杉醇脂质 体颗粒对肿瘤的抑制效果相差无几,但均要明显好于游离紫杉醇。 1.2.1.2 脂质体研究的发展过程 (1)第一代脂质体 药物被天然或人工合成的磷脂以及胆固醇组成
23、的双层膜包封的最基本、最简单的 脂质体结构。主要功能为降低毒性和增加药效。已经上市生产的脂质体药物大部分属 于第一代脂质体。 (2)第二代脂质体 表面用聚乙二醇-磷脂衍生物修饰的脂质体。修饰后的脂质体提高了药物在血液中 的循环时间,增加了药物的被动靶向功能。聚乙二醇-脂质体阿霉素(Doxil)已经通过 美国食品药品监督管理局(FDA)认证,上市生产。多种聚乙二醇-脂质体也已进入临 床/期阶段。 (3)第三代脂质体 脂质体表面修饰聚乙二醇(PEG)并在聚乙二醇终端引入靶向基团,这些靶向基 团可以是单克隆抗体、多糖、叶酸、维生素B12和多肽。这类脂质体药物已经进入临床 /期阶段。 (4)第四代脂质
24、体 通过修饰使脂质体具有靶向性、可控释放性、pH敏感性及其他可控性能,从而提 高药效。这类脂质体具有一定可控性故称智能脂质体。目前第四代脂质体还处于实验 室研究阶段。 硕士学位论文 5 1.2.1.3 脂质体药物载体的应用实例 脂质体以其良好的生物相容性和简便的制备方法在药物载体领域得到了广泛的应 用。并且有部分药物-脂质体产品已经得到 FDA 批准上市,包括脂质体阿霉素 (Doxil)17、脂质体两性霉素(AmBisome) 、脂质体柔红霉素(DaunoXome) 、脂质 体阿糖胞苷(DepoCyt)、脂质体吗啡(DepoDur)以及新型光敏剂脂质体维替泊芬 (Visudyne)18-19。
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