东北师范大学生物基础实验教学中心教学课件.ppt
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1、实验一 植物组织水势的测定 (小液流法),一、原 理,当植物细胞或组织放在溶液中时,如果植物的水势小于溶液的渗透势(溶质势),则组织吸水而使溶液浓度变大;反之,则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小;若植物组织的水势与溶液的渗透势相等,则二者水分保持动态平衡,外部溶液浓度不变,此溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液浓度的变化。然后根据公式计算其渗透势。,二、仪 器 药 品,试管 毛细吸管(尖端弯成90度) 移液管 单面刀片 镊子 次甲基蓝,三、实 验 步 骤,1首先配制一定浓度蔗糖溶液(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7
2、,0.8M)各10ml,注入试管中,各管都加上塞子,并编号。按编号顺序排成一列,放在试管架上,作为对照组。 2另取8支试管,编好号,按顺序放在试管架上,作为试验组。然后由对照组中之各试管中分别取溶液4ml移入相同编号的试验组试管中,再将各试管都加上塞子。,3用刀片将马铃薯切成7mm7mm、厚约2mm大小相等的小块,共80块。向试验组的每一试管中各加相等数目的马铃薯小片,塞好塞子,放置30分钟,在这段时间内摇动数次,到时间后,向每一试管中各加次甲基蓝粉末少许,并振荡,使溶液着色均匀。,4用毛细吸管从试验组的各试管中依次吸取着色的液体少许,然后伸入对照组的相同编号试管的液体的中部,缓慢放出一滴蓝色
3、试验溶液,并观察小液流移动的方向,并记录之。,5计算 记录小液流不动的试管中蔗糖溶液的浓度,按=RTiC计算水势值。 C等渗浓度(mol/L) R气体常数(0.008314MPa/L/mol/K) T绝对温度 i解离系数(蔗糖1,CaCl22.60),【思考题】 1测定同一植物上部及下部叶片的水势有何差别。 2用小液流法测定植物组织水势与用质壁分离法测定植物细胞渗透势都是以外液的浓度算出的溶质势为根据,他们之间的区别何在。,实验二 氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定根系活力,一、原理,氯化三苯基四氮唑(TTC)是标准氧化还原电位为80mV的氧化还原物质,溶于水中成为无色溶液,但还原后即生成红色而
4、不溶于水的三苯基甲 (TTF),如下式:,生成的TTF比较稳定,不会被空气中的氧自动氧化,所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体,植物根所引起的TTC还原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强,而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性,并作为根系活力的指标。,二、材料、设备仪器及试剂,(一)材料: 水培或砂培小麦、玉米等植物根系。 (二)仪器设备: 分光光度计; 分析天平(0.1mg); 电子顶载天 平(感量0.1g); 恒温箱1台; 研钵1套; 三角 瓶50ml; 漏斗; 量筒100ml; 移液管10ml 、2ml 1支、0.5ml 各1支; 刻度试管10ml; 试管架;
5、容 量瓶10ml; 药勺; 石英砂适量; 烧杯10ml、 1000ml; 小培养皿,二、材料、设备仪器及试剂,(三)试剂: 1. 乙酸乙酯(分析纯)。 2. 次硫酸钠(Na2S2O4,强还原剂,俗称保险粉),分析纯。 3. 1TTC溶液:准确称取TTC1.0g,溶于少量水中。定容到100ml。用时稀释至各需要的浓度。 4. 磷酸缓冲液(115mol/L,pH7)。 5. 1mol/L硫酸:用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml,边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000ml。 6. 0.4mol/L琥珀酸:称取琥珀酸4.72g(含6个结晶水10.81g),溶于水中,定容至10
6、0ml即成。,三、实验步骤,1定性测定 (1)配置反应液 把1%TTC溶液,0.4moL/L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按154比例混合。 (2)把根仔细洗净,把地上部分从茎基切除,将根放入三角瓶中,倒入反应液,以浸没根为度,置37左右暗处放1h,以观察着色情况,新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色,表明该处有脱氢酶存在。,三、实验步骤,2定量测定 (1)TTC标准曲线的制作 吸取0.25ml 0.4%TTC溶液放入10ml容量瓶,加少许Na2S2O4粉末,摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置1
7、0ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含TTF25g、50g、100g、150g、200g的标准比色系列,以空白作参比,在485nm波长下测定光密度,绘制标准曲线。,三、实验步骤,(2)称取根样品0.5g,放入小培养皿,加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml,把根充分浸没在溶液内,在37下暗处保温1h,此后加入1mol/L硫酸2ml,以停止反应。(与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品,其他操作同上)。 (3)把根取出,吸干水分后与乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起磨碎,以提出TTF。把红色提出液移入试管,用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次,皆移入试管,最后加乙酸乙酯使总
8、量为10ml,用分光光度计在485nm下比色,以空白作参比读出光密度,查标准曲线,求出四氮唑还原量。,四、结果计算,四氮唑还原强度:,根重(g)时间(h),mg/g(根鲜重)/h=,四氮唑还原量(mg),实验三 植物体内硝酸还原酶 活力的测定,一、原理,硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶,它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐 。 产生的亚硝酸盐与对氨基苯磺酸(或对氨基苯磺酰胺)及萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。,生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰,可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Ngg1h1为单位。,分光光度计
9、; 真空抽气泵(或20ml注射器筒); 天平; 单面刀片; 保温箱(或恒温水浴); 刻度试管(15ml); 移液管(5ml2,2ml8,1ml2)。,二、仪器与设备,三、试验试剂,亚硝酸钠标准液: 称取分析纯NaNO2 0.1000g水溶后定容至100ml,吸取5ml用水稀释定容至1000ml,即为每ml含NaNO2 5g(亚硝态氮近似1g/ml)的标准液。 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液:K2HPO4 19.24g,KH2PO4 2.2g,加水溶解后定容至1000ml。,三、试验试剂,1%(W/V)对-氨基苯磺酸溶液:称取1.0g加入25ml浓HCl中,用蒸馏水定容至100ml。
10、0.2%(W/V)-萘胺溶液:称取0.2g-萘胺溶于25ml冰醋酸中,用蒸馏水定容至100ml。,30%三氯乙酸溶液:75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。 KNO3(0.1mol/L)、异丙醇(1% V/V)、磷酸缓冲液(0.1mol/L)混合液:称3.03g KNO3溶于300ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中,再加3ml异丙醇混匀。,1.标准曲线制作 : 取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂,即配成02.0g的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮(g)为横坐标,光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归
11、方程。,四、实验步骤,2酶反应和酶活性测定 (1)取样 将材料(小麦、玉米等作物叶片)洗净,用蒸馏水冲洗,滤纸吸干。在叶片中部打取直径1cm的圆片(或剪成0.51.0cm2的小块),混匀后每个样品称0.51.0g 3份,放入试管并编号。,(2)反应 向各试管加入KNO3异丙醇磷酸缓冲液混合液9ml,其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混匀作对照。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气,反复几次直至叶片沉在管底。将各试管置30下于黑暗处保温30min,分别向处理管加1.0ml三氯乙酸,摇匀终止酶活性。,(3)比色 将各试管静置2min,吸取上清液2ml加入另一组试管,以对照管做参比,按标准曲线做法
12、进行显色测定,并计算酶活性(Ngg1h1)。 酶活性:,C反应液催化产生的亚硝态氮总量(g) V1提取酶液时加入的缓冲液体积(ml) V2酶反应时加入的粗酶液体积(ml) W样品重量(g) t反应时间(h),实验四 钾离子对植物气孔开度的影响,一、原理,保卫细胞的渗透系统可由钾离子所调节,无论是环式或非环式光合磷酸化都可形成ATP,ATP不断供给保卫细胞膜上的H+泵作功,使保卫细胞中的H+泵出,并从周围表皮细胞吸收钾离子,降低保卫细胞的水势,使保卫细胞吸水,气孔张开。 要求:了解K对蚕豆气孔运动的影响,二、实验材料、仪器、试剂,(一)材料:蚕豆叶片 (二)仪器设备: 倒置显微镜;弯头滴管;镊子
13、;打孔器; 培养皿;温箱;盖玻片。 (三)试剂: 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/L硝酸钾、硝酸钠。,三、实验步骤,(一)在培养皿中各加入不同浓度梯度的KNO3、NaNO3溶液及蒸馏水15m1。 (二)撕取蚕豆叶下表皮若干放入上述三组培养皿中。 (三)将培养皿放入25温箱中,光照条件下照光半小时,然后在镜下观察气孔开度。 (四)每组处理统计150个气孔开度,计算平均值,比较开度大小。,实验五 叶绿体色素的提取、分离,一、原理,叶绿体中含有绿色素(包括叶绿素a和叶绿素b)和黄色素(包括胡萝卜素和叶黄素)两大类。 这两类色素都不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇、
14、丙酮等有机溶剂提取。 提取液可用色谱分析的原理加以分离:因吸附剂对不同物质的吸附力不同,当用适当的溶剂推动时,混合物中各种成分在两相(固定相和流动相)间具有不同的分配系数,所以移动速度不同,经过一定时间后,可将各种色素分开。,二、材料、仪器设备及试剂,(一)材料:菠菜、小白菜叶片 (二)仪器设备 研钵;漏斗;三角瓶;剪刀;滴管;培养皿(直 径11cm);康维皿或平底短玻管;圆形滤纸(直 径11cm) (三)试剂 95乙醇;石英砂;碳酸钙粉; 推动剂:按石油醚;丙酮:苯(10:2:1)比例配 制(VV)。,三、实验步骤,1. 叶绿体色素的提取 (1)取菠菜新鲜叶片45片(2g左右),洗净,擦干,
15、去掉中脉剪碎,放入研钵中。 (2)研钵中加23ml95乙醇,研磨至糊状,再加1015ml95乙醇,提取35min,上清液过滤于三角瓶中,残渣用10ml95乙醇冲洗,一同滤于三角瓶中。,2. 叶绿体色素的分离 (1)取圆形定性滤纸一张(直径11cm),在其中心戳一圆形小孔(直径约3mm)另取一张滤纸条(5cm1.5cm),用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边,使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内,风干后,再重复操作数次,然后沿长度方向卷成纸捻,使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。 (2)将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中,使与滤纸刚刚平齐(勿突出)。,(3)在
16、培养皿内放一康维皿,在康维皿中央小室中加入适量的推动剂,把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上,使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。 (4)当推动剂前沿接近滤纸边缘时,取出滤纸,风干,即可看到分离的各种色素:叶绿素a为蓝绿色,叶绿素b为黄绿色,叶黄素为鲜黄色,胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。,实验六 叶绿素含量的测定,一、原理,根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。,二、材料、仪器设备及试剂,(一)材料
17、:新鲜(或烘干)的植物叶片 (二)仪器设备: 分光光度计;电子顶载天平(感量0.01g); 研钵;棕色容量瓶;小漏斗;定量滤纸; 吸水纸;擦境纸;滴管 (三)试剂: 96乙醇(80丙酮);石英砂;碳酸钙粉。,三、实验步骤,1. 取新鲜植物(菠菜)叶片(或其它绿色组织)或干材料,擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉),混匀。 2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g,共3份,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及2-3ml95乙醇,研成均浆,再加乙醇10ml,继续研磨至组织变白。静置3-5min。,三、实验步骤,3. 取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25ml棕色容量瓶中,
18、用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后用乙醇定容至25ml,摇匀。 4. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95乙醇为空白,在波长665nm、649nm下测定吸光度。,四、实验结果计算,将测定得到的吸光值代入下面的式子: Ca=13.95A6656.88A649 Cb=24.96A6497.32A665 Cr=18.08 A649+6.63 A665 (Ca、Cb:mg/L) 叶绿素的含量(mg/g)= 叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重,实验七 叶绿体光诱导荧光强度的测定,一、原理,叶绿体色素在照光时能辐射出荧光。 研究叶绿体色素荧光性质,有助于了解它的分子激发态,分子之
19、间的能量传递以及分子在活体内的排列。叶绿体光诱导荧光强度的变化(以下简称可变荧光)是由于叶绿体吸收光能后,光能在转化和电子传递过程中受阻,能量不能正常的传递下去,而以荧光的形式释放出来,使荧光的强度增加。如果这种变化是由光的影响引起的,就叫光诱导的可变荧光。,一、原理,叶绿体在685nm处呈现一个荧光发射峰,它是由光系统II发射出来的,这部分荧光称为固定荧光(F0),是物理性的,它与光系统II的原初反应和电子传递无关当对叶绿体进行光诱导时,而发射出的荧光叫可变荧光(F)。固定荧光和可变荧光之和称为总荧光(Fmax)。由此可见,可变荧光(F)可以代表光系统II反应中心可能利用及转化能量的能力。所
20、以,F在一定程度上代表光系统II反应中心的活性。而可变荧光与固定荧光的比值则表示光系统II的光能转换效率。因此,可作为叶绿体光化学活性的一个重要指标。,二、材料、仪器设备及试剂,(一)材料:玉米、菠菜叶 (二)仪器设备: 组织捣碎机;冷冻离心机;玻璃匀浆器; 冰箱;动力学分光光度计 (三)试剂: 叶绿体制备缓冲液(简称制备液)。 0.05mol/L 磷酸缓冲液,内含0.3mol/L 蔗糖和0.1mol/L KCl,pH7.2。,三、实验步骤,叶绿体的制备 称取10g新鲜植物叶片,用水洗净、吸干,置于预冷的组织捣碎机的玻璃缸内,加入50ml制备液,用4层纱布将匀浆过滤,滤液在0下用1000g离心
21、10min。弃去上清液,在沉淀中加入40ml制备液悬浮,再次用1000g离心10min,取出沉淀,用15ml制备液在玻璃匀浆器内匀浆,则得叶绿体悬浮液备用。,三、实验步骤,2. 在光电倍增管前加一个684nm的滤光片,并把激发光波长调到436nm或480nm。 3. 调整基线 将空白缓冲液倒入比色杯中,放入样品室的样品架上,打开激发光谱录基线,如果信号过大,说明滤光片漏光,需更换。 4. 样品测定 将待测的叶绿体样品放入比色杯,并放到样品室内。打开激发光,记录固定荧光。再打开诱导光,记录最大荧光强度(Fmax)。,四、结果计算,根据记录的图谱,计算出固定荧光(F0)和总荧光(Fmax)的数值,
22、并按下述公式计算可变荧光和可变荧光产率。 可变荧光FFmaxF0 可变荧光率F/F0,实验八 光合作用离体叶绿体 的光还原反应,Hill反应,一、原理,希尔反应(Hill reaction)是绿色植物的离体叶绿体,在光下分解水放出氧气同时还原电子受体的反应。 氧化剂2,6-二氯酚靛酚是一种蓝色染料,接受电子和H后被还成无色,可以观察颜色的变化,也可用分光光度计还可以对还原量进行精确测定。,二、材料、仪器设备及试剂,(一)材料: 菠菜或其它绿色植物新鲜叶片。 (二)仪器设备: 研钵;石英砂;小试管;试管架;漏斗; 纱布;小烧杯; 剪刀 (三)试剂: 0.1 2,6-二氯酚靛酚,三、实验步骤,取新
23、鲜的菠菜或其它植物叶片0.5g,剪碎后放入研钵中,研磨成匀浆。 加50ml蒸馏水,通过56层纱布,过滤到小烧杯中,即得到叶绿体粗悬浮液。 取试管两支。每管中加入叶绿体悬浮液5ml,0.12,6-二氯酚靛酚溶液5-6滴,摇匀。将一管置于直射光下,另一管置于暗处,注意日光下的试管液颜色变化。58min后,将置于暗处的试管取出,比较两管溶液颜色变化,解释原因。,实验九 植物种子生命力的快速测定,.TTC法 一、原理,TTC(2,3,5三苯基氯化四氮唑)氧化态是无色的,可被氢还原成不溶性红色三苯甲月替(TTF)。 用TTC溶液浸泡种子,如果种胚具有生命力,其脱氢酶就可以将TTC还原成为三苯甲月替而呈红
24、色;如果种胚死亡便不能染色.,二、材料、仪器设备及试剂,(一)材料: 小麦种子 (二)仪器设备: 小烧杯;刀片;镊子;温箱 (三)试剂: 0.120.5TTC溶液,三、实验步骤,将种子用温水(约30)浸泡26h 随机取种子100粒,然后沿种胚中央准确切开,取其一半备用。 将准备好的种子浸于TTC试剂中,于恒温箱(3035)中保温30min。 反应结束,观察种胚的情况,凡种胚全部或大部分被染成红色的即为具有生命力的种子。种胚不被染色的为死种子,如果种胚中非关键性部位(如子叶的一部分)被染色,而胚根或胚芽的尖端不染色都属于不能正常发芽的种子。,.染料染色法 一、原理,有生命力种子胚细胞的原生质膜具
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