脆性X三综合征研究进展.doc
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1、脆性X综合征研究进展作者:张宁,赵文清,郭文潮,陈伟华,李小玲,刘建辉 作者单位:050000 石家庄,河北医科大学第二医院心内科(张宁); 050051 石家庄,河北省人民医院神经科(赵文清、郭文潮、陈伟华、李小玲、刘建辉) 【关键词】 脆性X综合征 研究进展脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是一种导致智力低下、发病率仅次于唐氏综合征的X连锁遗传病,国外报道FXS在西方男性群体中的发生率为1/1 250,女性为1/2 500。该综合征在所有智力发育不全的患者中的比例,西方人群为2.6%8.7%13。本文就有关研究综述如下。1 FXS的分子学基础本综合征由Lubs于1
2、969年最先报告,1977年,Sutherland4根据细丝部位易断裂而造成远端随体样结构的丢失,而称此细丝部位为脆性部位,此X染色体即被称为脆性X染色体,并用G显带方法证实该脆性部位只在Xq27或Xq28。1985年,Mulligan等5将其准确定位于Xq27.3带。1991年Verkerk等6首次应用酵母人工染色体技术,在Xq27.3 处成功克隆出家族性智力低下基因FMR1(fragile X mental retardation 1),研究证明该基因与FXS有密切相关。现已知道FMR1基因有17个外显子,长度38 kb,表达产物为一种RNA结合蛋白,RNA结合蛋白对转录体的剪切、RNA转
3、运、mRNA稳定性及翻译水平有重要调节作用。患者FMR1基因的5端非翻译区有遗传不稳定的CGG三核苷酸重复序列的扩增,有邻近的CpG岛的异常甲基化,几乎所有患者FMR1的mRNA及其蛋白产物不表达或低表达。产生全突变的FMR1在卵母细胞内尚未发生甲基化,而在体细胞是甲基化的。因此,FMR1异常甲基化和失活发生在受精之后的早期胚胎7。正常人群FMR1基因中(CGG)n存在多态性,重复序列为646个拷贝8,而突变为该序列的高度重复。根据CGG扩增程度可把其突变分为以下3种类型:(1)前突变。见于正常男、女传递者,CGG重复52200拷贝,无CpG岛甲基化,各种体细胞中基因改变一致。(2)全突变。见
4、于男、女患者和部分女性携带者,CGG重复高于200拷贝,CpG岛完全 甲基化或高度甲基化,存在广泛的体细胞异质性。(3)嵌合型。属于一种中间类型,约占基因突变类型的15%,具有前突变的基因型以及较低程度的CpG岛甲基化和体细胞不稳定性。CGG重复序列不同程度的扩增可引起邻近CpG岛内不同程度甲基化,而CpG岛的过度甲基化可能抑制FMR1基因的正常转录、表达从而出现临床症状。FXS是CGG重复过度增加和相邻区异常甲基化的结果9。近几年来越来越多的家系调查发现,FXS的遗传方式非常复杂,具有与一般遗传性疾病完全不同的特殊的遗传规律,很难用孟德尔规律来说明。临床以智力低下、巨睾症、特殊面容、语言行为
5、障碍为特征。主要为男性发病、女性携带者可有异常表型。2 FXS的临床表现不同年龄和性别的FXS患者临床表现不同,而且同一症状的程度也可不同,主要包括中度到重度的智力发育不全、大睾丸,常伴有大耳、单耳轮、下颌前突、腭弓高、淡蓝色巩 膜、语言障碍、癫痫等9。2.1 特殊面容 包括脸长、前额突出、耳廓大、腭弓高、嘴大唇厚等。2.2 大生殖器 巨睾,多数在青春期发生,睾丸体积大于正常同龄人的最高值即可称巨睾。正常成年人平均睾丸体积为1.8 cm3,大于2.5 cm3者为巨睾。2.3 智力低下 男性患者中度以上智力低下者占80%以上,女性患者多表现为轻度智力障碍、学习困难,尤其计算能力差。青春期前的患者
6、多为轻度智力低下,研究提示随年龄增长,智力水平下降,年龄较大者多为中重度智力低下。另外抽象思维有明显缺陷。有的女性携 带者可有轻度智力低下,一般认为是由于女性携带者的2条X染色体中,正常X染色体随机失活,异常X染色体具有活性的结果9。2.4 癫痫发作 X染色体长臂上有基因突变时,约20有癫痫发作。家系调查中统计癫痫发生率为33.3%。睡眠期易出现发作和EEG异常,其特点与中央颞棘波型良性儿童癫痫相似,癫痫发作类型以强直阵挛性发作多见,其次为复杂部分性发作,发作一般不频繁,多发生在儿童或青少年期,成年后症状消失。EEG常见为一侧或两侧颞叶的中、高波幅棘波,睡眠状态下多见,临床无癫痫发作的患者也可
7、见此EEG异常2,10。2.5 语言障碍 为本综合征常见的特征。Lubs等11提出X染色体上有一个或几个与语言功能相关的基因。因此,X染色体异常可导致发音缺陷及言语障碍。常表现为会话和言语表达能力的发育严重迟缓,学语年龄延迟、词汇量少、语言单调、经常自言自语。2.6 行为障碍 绝大多数患者有多动、注意力不集中,情绪易激动,狂躁,有破坏行为,常撕坏衣物,打碎东西或突如其来的攻击行为。如对母亲等亲人或不相识的人进行突然袭击,给人以致命的伤害。孤独症也较常见,大多数患者表现为胆小、羞怯、温顺,在监护下可以参加简单的劳动,如送牛奶,回到家中,但少数可有脾气烦躁表现12。3 FXS的诊断目前可采用的检测
8、方法是在细胞和分子水平上对FXS进行诊断和出生前诊断。3.1 细胞遗传学方法 20世纪80年代对FXS的诊断主要采用细胞遗传学方法。一般用缺叶酸培养基加入5%的小牛血清,培养患者外周血淋巴细胞,再加入诱导剂5-氟尿嘧啶核苷(FudR)等诱导脆性位点的表达,表达频率一般在4%左右,表达频率低者易漏诊。我们建立了一套低叶酸培养基加双诱导双定位方法(包括外周血淋巴、羊水等细胞培养方法),在FXS的家系中,男性患者绝大多数有Fra(X)表达,其表达频率最高可达50%12,13。采用羊水细胞、绒毛及胎血进行FXS的产前诊断。研究表明,绒毛和羊水细胞、胎儿脐血诱导Fra(X)的表达率比外周血低,所需时间长
9、。脆性位点是分布在人类染色体上的一个特定部位。经分析其有以下4个特征:(1)具有宽度不等的不被染色的裂隙,常涉及2个染色单体;(2)在一个个体或一个家系中,脆性位点总是恒定地出现在某一染色体的同一位置上;(3)其遗传方式为孟德尔共显性遗传(在FXS中呈X连锁隐性遗传);(4)在体外适当的培养条件下,可以诱导出脆性位点。3.2 分子遗传学方法3.2.1 Southern印迹杂交: 是指DNA与DNA的杂交,将电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定的固相支持物上,然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。首先取患者外周血标本5 ml,放入2% EDTA溶液抗凝,提取DNA。采用DNA杂交分
10、析方法检测FMR基因,能确诊男性患者,并对可疑的女性病例作出排除性诊断。Southern杂交法采用酚氯仿法提取DNA,应用StB12.3探针。取30 g探针,100水浴15 min后,立即放入碎冰中,加入随机引物和dNTPs及KLenow聚合酶,用50V的a-32pdcTP标记。37 25 h后,SephadexG-50柱层析分离标记的探针;DNA杂交,取DNA标本20 g经EcoRI内切酶,37酶切15 h。酶切后的基因组DNA样品电泳,1.5 V/cm,24 h后Southern转移,杂交,洗膜。-70冰箱冷冻并曝光27 d13。3.2.2 PCR法:Fu等14最先将PCR技术用于CGG重
11、复序列的检测。应用CGG重复序列两侧引物直接扩增DNA片段,其产物经琼脂糖或变性序列凝胶电泳分离,转印后与同位素或非同位素标记的寡核苷酸探针杂交,可检测扩增物。也可以银染方法直接检测PCR产物,即可精确测定重复序列拷贝数。Zhou等15采用荧光甲基化特异性PCR和基因组扫描对FXS进行诊断,用重亚硫酸盐分别处理患者和正常人的DNA,随后应用荧光标记的引物进行甲基化特异性PCR扩增,扩增产物毛细管电泳进行分型。基因组扫描结果中荧光峰的多少及其分型能确定FMR1突变情况。每种FMR1基因型产生其特有的基因组扫描电泳图,由此可以确定不同疾病分型。正常及前突变的CGG的重复数目能被精确检测。通过对一个
12、FXS家系分别进行Southern印迹杂交和PCR的检测,证明2种方法的一致性。荧光甲基化特异性PCR,简化了检测FXS的分子遗传学诊断方法2,15。3.2.3 转录水平检测: 是一种基因表达异常的诊断。通过RNA诊断可对待测基因的转录产物(mRNA)进行定量分析,检测其转录加工的缺陷以及外显子的变异等,mRNA长度分析可采用Northern杂交法。Pieretti等16研究发现绝大多数男性患者有FMR1 mRNA。少数男性患者体内因CpG岛不完全甲基化而有少量表达。Feng等17还通过Northern杂交RT-PCR等对正常及前突变等研究发现,二者FMR1 mRNA转录过程、表达水平及稳定性
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