碱性磷酸酶米氏常数的测定.ppt
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1、碱性磷酸酶米氏常数的测定,浙江中医药大学生命科学学院 生物化学教研室,目的与要求 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定,了解其测定方法及意义。 学会运用标准曲线测定酶的活性,加深对酶促反应动力学的理解。,原理,酶催化底物发生反应时,受多种因素影响,环境的温度、pH和酶的浓度等等,在环境的温度、pH和酶的浓度一定时,酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度,反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时,反应速度会达到一个极限值,即最大反应速度(Vmax),如图37所示,底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michae
2、lis-Menten方程式表示。 V = VmaxS/(Km+S) 上式中Vmax为最大反应速度,S为底物浓度,Km为米氏常数(Michaelis constant),而其中V则表示反应的起始速度。当V= Vmax/2时,Km =S。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此Km的单位以摩尔浓度(molL)表示。 Km是酶的最重要的特征性常数,测定Km值是研究酶动力学的一种重要方法,大多数酶的Km值在0.01-100(mmol/L)间。,酶促反应的最大速度Vmax实际上不易准确测定,Km值也就不易准确测出。林-贝 (1ineweaver - Burk)根据Michaelis-
3、Menten方程,推导出如下方程式,即:(两边取倒数) 1/V = (Km +S)/ VmaxS 或1/V = Km/ Vmax(1/S)+1/ Vmax (得类似:y=ax+b的直线方程 ) y = 1/V, a = Km/ Vmax, x = 1/S b = 1/ Vmax,此式为直线方程,以不同的底物浓度1/S为横坐标,以1/V为纵坐标,并将各点连成一直线,向纵轴方向延长,此线与横轴相交的负截距为-1/ Km,由此可以正确求得该酶的Km值,如图所示。,本实验以碱性磷酸酶为例,测定不同底物浓度的酶活性,再根据Lineweaver-Burk法作图,计算其Km值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质
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