2019通脉口服液对实验性糖尿病肾病模型大鼠肾脏病理及转化生长因子β1的影响.doc
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1、DOC格式论文,方便您的复制修改删减通脉口服液对实验性糖尿病肾病模型大鼠肾脏病理及转化生长因子1的影响(作者:_单位: _邮编: _) 【摘要】 【目的】观察通脉口服液对实验性糖尿病肾病(DN)模型大鼠肾脏病理及转化生长因子1(TGF1)的影响。【方法】选用SD雄性大鼠,随机分为正常对照组(8只),腹腔注射等剂量无菌柠檬酸柠檬酸钠缓冲液,饲普通饲料;其他动物(32只)为造模组给予链脲佐菌素(STZ,剂量为55mg/kg)单次腹腔注射,隔日饲高脂饲料;4周后筛选DN成模大鼠共21只,随机分为模型组(11只)、通脉组(10只)。通脉组给予通脉口服液(剂量为2.5 gkg-1d-1),正常对照组及模
2、型组给予生理盐水灌胃,饲料同前。6周后处死大鼠取肾组织,光学显微镜及电子显微镜下观察肾脏组织形态及超微结构变化,测量肾小球截面积(AMG)、细胞外基质截面积(AMM)、肾小球基底膜(GBM)厚度,计算AMM/AMG比值;同时采用免疫组化法测定肾组织TGF1蛋白表达。【结果】肾组织病理形态学:通脉组系膜区增宽、基底膜增厚及肾小管上皮细胞空泡变性等均较模型组明显减轻; 通脉组AMM/AMG值较模型组降低;GBM厚度较模型组变薄(均P0.001);TGF1主要定位在肾小管及间质处,肾小球表达较弱, 通脉组免疫组化染色面密度及积分光密度均较模型组降低(P0.001)。【结论】益气活血中药复方通脉口服液
3、可能通过抑制肾组织TGF1表达,减轻肾脏病理损害,发挥对DN的肾脏保护作用。 【关键词】 通脉口服液/药理学; 糖尿病肾病/中药疗法; 肾组织/病理学; 肾组织/超微结构; 疾病模型,动物; 大鼠糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一。在我国DN约占终末期肾病的15%,且以每年8%10%的速率递增1。有关DN的防治研究一直是医学研究的重点。 DN的主要病理学改变是肾小球基底膜(GBM)增厚及系膜区基质增生,这些变化的组织学基础是细胞外基质(ECM)不适当的积聚2。转化生长因子(TGF)是DN发生、发展中最重要的一个细胞因子,在人类肾脏中以1为
4、主。TGF1可以在基因表达、转录及其他多方面调节ECM成分的生成及降解,诱导肾脏肥大3。本试验观察了通脉口服液对DN模型大鼠肾脏病理及TGF1蛋白表达的影响,现报导如下。 1 材料与方法 1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠40只,体质量260280g(广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:0017114)。 1.2 药物、试剂与仪器 通脉口服液为广东省中医院自制制剂,批号:06080709;链脲佐菌素(STZ)由美国Sigma公司提供,用时以0.1mol/L(pH 4.2)无菌柠檬酸柠檬酸钠缓冲液配制成10mg/L的STZ溶液,即配即用;免疫组化SP二步法测大鼠肾组织TGF1用试剂盒由博士
5、德生物工程有限公司提供;EICACUT型超薄切片机为德国LEICA公司产品;EclipseE800型光学显微镜为日本Nikon公司产品;JEM1200EX型透射电镜为日本电子株氏会社产品;HMIAS2000型高清晰度彩色病理图文分析系统为武汉千屏影像技术有限责任公司产品。 1.3 糖尿病肾病大鼠模型的复制 4 取SPF级SD雄性大鼠40只,自由饮水和进食3d以适应环境后随机分为正常对照组(8只)、造模组(32只)。造模组在禁食不禁水24h条件下,单次腹腔注射 STZ(剂量为55mg/kg),禁食不禁水6h,72h后尾静脉取血测血糖,取空腹血糖(FBG)值16.8mmol/L大鼠继续造模,隔日饲
6、以高脂饲料;正常对照组同等条件下腹腔注射同等剂量无菌柠檬酸柠檬酸钠缓冲液,饲以普通饲料。4周末于尾静脉采血测血糖,代谢笼法测24h尿蛋白定量,以FBG值16.8mmol/L,24h尿蛋白定量20mg判定为DN大鼠造模成功。 1.4 分组与给药 共有21只大鼠达到DN模型标准。随机分为模型组11只、通脉组10只。造模过程中,大鼠共死亡4只,原因考虑为STZ毒性及高血糖。 大鼠的用药量根据成人常用药量及人体与大鼠体表面积换算。正常对照组、模型组以生理盐水10mLkg-1d-1剂量灌胃;通脉组以通脉口服液2.5gkg-1d-1剂量灌胃(用时以生理盐水稀释浓度为0.25g/mL)。 1.5 观察指标
7、干预6周后共存活大鼠:正常对照组7只,模型组6只,通脉组7只。 1.5.1 光学显微镜检查及形态学检测结果判定标准 每组随机抽取6只大鼠肾组织制备标本,行过碘酸雪夫反应 (PAS)染色,光镜下观察肾脏的组织形态学变化,400倍视野下,每张切片随机采集 20个肾小球图像,导入病理图文分析系统,测量肾小球截面积(AMG:肾小球在切片中的横截面积)、细胞外基质截面积(AMM:肾小球横截面中 PAS 阳染面积),计算细胞外基质截面积/肾小球截面积比值(p=AMM/AMG100%)。 1.5.2 透射电子显微镜检查及GBM厚度测定标准 每组随机抽取3例标本,每例标本随机挑选3个肾小球行电镜检测。电镜下观
8、察肾脏的组织形态学变化,20 000 倍视野下,随机采集图像导入病理图文分析系统,选取与上皮细胞足突垂直处的肾小球毛细血管基底膜测量GBM厚度。每个小球随机测量30处,以平均厚度纳入统计。 1.5.3 TGF1蛋白表达 系统定标,显微摄像系统400倍视野下,每张标本随机选取10个视野釆图,将图像导入图像分析系统,选取免疫组化分析模块进行分析,以均值计算每例标本的阳性目标面积(A阳性目标)、面密度(p=A阳性目标/A统计场100%)、积分光密度(D积分=D平均A阳性目标)。 1.6 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包建立数据库,并进行统计分析。采用双侧检验(=0.05),多组间均数比较应
9、用单因素方差分析。 2 结果 2.1 各组DN大鼠肾组织形态与比较 正常对照组见肾小球体积、细胞形态和结构正常,间质未见炎细胞浸润及纤维化,各级肾小管及集合管结构清晰,肾小管管腔、刷状缘、细胞浆颗粒及细胞核均未发现明显异常改变;模型组见肾小球体积增大,大小不均,系膜区增宽,球内部分PAS染色阳性区域成团块状,基底膜不均一性增厚;通脉组见肾小球体积轻度增大,系膜区轻度扩大,部分肾小球仍存在毛细血管基底膜不均一增厚,但较模型组有所改善,结果见图1。 2.2 各组细胞外基质截面积/肾小球平均截面积变化 模型组AMM/AMG比值较正常对照组增加,通脉组AMM/AMG比值较模型组降低,组间比较差异均有显
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