2019阿仑磷酸钠和辛伐他汀对体外培养成骨细胞的影响.doc
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1、DOC格式论文,方便您的复制修改删减阿仑磷酸钠和辛伐他汀对体外培养成骨细胞的影响(作者:_单位: _邮编: _) 作者:崔维顶李煜明魏新程【摘要】 目的 探讨辛伐他汀和阿仑磷酸钠对体外培养成骨细胞的影响。方法 分离3周龄成骨细胞,体外培养时以辛伐他汀和阿仑磷酸钠刺激,观察成骨细胞碱性磷酸酶水平和成骨细胞增殖率。结果 辛伐他汀、阿仑磷酸钠可以促进成骨细胞增殖,增加碱性磷酸酶的分泌,二者共同作用后作用更显著。结论 辛伐他汀和阿仑磷酸钠能促进成骨细胞增殖和分泌碱性磷酸酶,可以联合作用促进骨形成。 【关键词】辛伐他汀;阿仑磷酸钠;成骨细胞 Effect of alendronate sodium an
2、d simvastatin on osteoblasts cultured in vitro 【Abstract】 Objective To study the effect of alendronate sodium and simvastatin on osteoblasts cultured in vitro Methods Three weeks old SD rats osteoblasts were isolated, osteoblasts were stimulated with alendronate and simvastatin, proliferation ratio
3、and alkaline phosphatase (ALP)activity were assessed Results Alendronate sodium and simvastatin not only promoted proliferation of osteoblasts, but also stimulatedALPactivity, combination of both drugs had a significant effect Conclusion Alendronate sodium and simvastatin can promote proliferation a
4、nd ALP activity of osteoblasts, which could be combinated to promote the form of bone 【Key words】Simvastatin;Alendronate sodium;Osteoblast 骨质疏松症已成为威胁老年人的多发病,阿仑磷酸钠是治疗骨质疏松的常见药物,主要作用机制是抑制破骨细胞的骨吸收,降低骨转换率。辛伐他汀主要用来治疗高脂血症,两种药物都通过抑制胆固醇代谢中的甲羟戊酸途径发挥作用,因此学者们发现辛伐他汀对骨代谢也有一定的影响。阿仑磷酸钠和辛伐他汀联合作用如何影响成骨细胞呢。本实验中笔者观察阿仑磷
5、酸钠和辛伐他汀对体外培养成骨细胞的影响,进一步探索两种药物对骨代谢的作用。 1 材料与方法 11 材料 3周龄SD大鼠(南京医科大学实验动物中心),DMEM-F12培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司),HEPES、谷氨酰胺、阿仑磷酸钠、辛伐他汀(美国Sigma公司),CO2培养箱(LB-7,日本池本理化工业株式会社),胰蛋白酶、MTT(美国Sigma公司)。 12 成骨细胞的培养 无菌条件下取大鼠颅盖骨,剪碎至1 mm3 大小,用PBS液充分冲洗。先后用025%胰蛋白酶和型胶原酶消化,离心去上清,沉淀的细胞加入含15胎牛血清的DMEM-F12培养液,吹打成细胞悬液。细胞计数板计数,调整细
6、胞浓度为1105 /ml,接种于25 cm2培养瓶,37、5 CO2饱和湿度的孵箱内培养,换液1次/3 d,当细胞在培养瓶中生长汇合后传代。 13 碱性磷酸酶染色 将二代成骨细胞计数,以1104/孔的密度接种于6孔培养板,DMEM-F12培养液培养。经过4 d左右,细胞生长接近铺满培养板底部后,吸去培养液,用PBS缓冲液冲洗,以95无水酒精固定10 min。吸去固定液,三蒸水冲洗3遍,每孔迅速加入2 l 1AP反应缓冲液、100 l NBT(nitro blue tetrazolium)溶液和50 l BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)溶液,混
7、匀,室温下放置30 min,PBS漂洗数次。晾干后镜下观察,-20保存。 14 药物对成骨细胞增值率的影响 将二代成骨细胞以密度为5103/孔接种于96孔培养板上。待其贴壁后,小心吸去培养液,将含各种浓度阿仑磷酸钠和辛伐他汀的DMEM-F12培养液02 ml加入到培养板,浓度分别为阿仑磷酸钠 110-6、110-7、110-8、110-9 mol/L和辛伐他汀110-6、110-7、110-8、110-9 mol/L组,DMEM-F12为阴性对照组,每组6个孔。放于孵箱培养72 h,各孔加入MTT液,20 l/孔,轻轻吹打,继续培养4 h。吸出孔内培养液后,加入DMSO液150 l/孔,室温下
8、将培养板置于微孔板震荡器震荡10 min,使结晶溶解。酶标仪检测各孔OD值,检测波长570 nm, 参考波长630 nm,检测阿仑磷酸钠和辛伐他汀对成骨细胞增值率的影响。以两种药物增殖率最高的浓度混合后检测两者共同作用的的影响。 15 药物对成骨细胞碱性磷酸酶的影响 将二代成骨细胞以密度5103/孔接种于96孔培养板,培养24 h后细胞完全贴壁,吸去培养液。将培养板分组,每组6个孔,将含阿仑磷酸钠和辛伐他汀各种浓度的DMEM-F12培养液02 ml加到培养板,浓度同前一步骤,DMEM-F12培养液为阴性对照组,共10组。培养72 h后,将1 ml反应液R1加到比色杯中,37孵育3 min后加入
9、20 l各待检测孔上清液,搅匀并保温30 s。加入250 l反应液R2到比色杯中,搅匀并保温30 s,然后用分光光度计测定405 nm处2 min内的吸光度变化,间接得出ALP活性值(U/L)。以两种药物ALP活性最高的浓度混合后再观察两者共同作用的影响。 16 统计学方法 实验数据采用SPSS 130统计软件包分析,各组测得MTT的吸光度和ALP活性的实验数据以均数标准差(xs)表示,采用方差分析,P值 005为差异具有统计学意义。 2 结果 21 成骨细胞染色 二代细胞经碱性磷酸酶染色显示大部分细胞呈阳性,细胞质中可见深蓝色ALP阳性颗粒,细胞突起清晰(见图1)。 22 药物对成骨细胞增殖
10、率的影响 110-8、110-9 mol/L的阿仑磷酸钠明显促进成骨细胞的增殖(P005),110-7 mol/L的浓度作用更强(P001),而110-6 mol/L的阿仑磷酸钠抑制成骨细胞的增殖。110-6、110-8 mol/L的辛伐他汀也明显促进成骨细胞的增殖(P005), 110-7 mol/L的浓度作用更强(P001),110-9 mol/L的浓度对增殖无明显影响(见表1)。联合使用两种药物后,成骨细胞的增殖率比单一药物有明显的增强(见表2)。23 药物对成骨细胞碱性磷酸酶的影响 4种浓度的辛伐他汀对碱性磷酸酶的分泌都有明显的促进作用,以10-8 mol/L的作用最强(P001);1
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