还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法.doc
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1、还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-
2、硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1. 实验材料小麦面粉;精密pH 试纸。2. 主要仪器(1)具塞玻璃刻度试管:20mL11(2)大离心管:50mL2(3)烧杯:100mL1(4)三角瓶:100mL1(5)容量瓶:100mL3(6)刻度吸管:1mL1;2mL2;10mL1(7)恒温水浴锅(8)沸水浴(9)离心机(10)扭力天平(11)分光光度计
3、3. 试剂(1)1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,混匀,4冰箱中保存备用。(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂将6.3gDNS 和262mL 2M NaOH 溶液,加到500mL含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中备用。(3)碘-碘化钾溶液:称取5g碘和10g碘化钾,溶于100mL蒸馏水中。(4)酚酞指示剂:称取0.1g酚酞,溶于250mL70%乙醇中。(5)6M HCl 和6M
4、 NaOH各100mL。四、操作步骤1. 制作葡萄糖标准曲线取7支20mL 具塞刻度试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作2. 样品中还原糖和总糖的测定(1)还原糖的提取准确称取3.00g 食用面粉,放入100mL 烧杯中,先用少量蒸馏水调成糊状,然后加入50mL 蒸馏水,搅匀,置于50恒温水浴中保温20min,使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到50mL 离心管中,于4000r/min下离心5min,沉淀可用20mL 蒸馏水洗一次,再离心,将二次离心的上清液收集在100m
5、L容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀,作为还原糖待测液。(2)总糖的水解和提取准确称取1.00g食用面粉,放入100mL三角瓶中,加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl,置沸水浴中加热水解30min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查)。待三角瓶中的水解液冷却后,加入1 滴酚酞指示剂,用6mol/LNaOH 中和至微红色,用蒸馏水定容在100mL容量瓶中,混匀。将定容后的水解液过滤,取滤液10mL,移入另一100mL容量瓶中定容,混匀,作为总糖待测液。(3)显色和比色取4支20mL 具塞刻度试管,编号,按表2 所示分别加入待测液和显色剂,空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等
6、其余操作与制作标准曲线相同。五、结果与计算:计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值,在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数,按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。 欢迎,客人 | 免费注册 | 会员登录 | 忘记密码?上网做生意,首选VIP会员| 设为首页| 加入桌面| 收藏本页| 手机版| 无图版| RSS订阅 人才 求购 供应 公司 首 页 食品资讯 政策法规 生产技术 质量管理 检验技术 仪器设备 食品标准 资料中心 翻译中心 培训中心 商务中心 食品人才 食品安全 食品课堂 食品专题 食品网刊 食品网址 数据库 知识堂 会展中心 考试中心 食品家园 食品论坛窗
7、体顶端糖的测定方法核心提示:对于糖的测定方法有很多,大致可分为三类1.物理法,(1.旋光法, 2 .折光法, 3.比重法,)2.物理化学法,(1.点位法对于糖的测定方法有很多,大致可分为三类1.物理法,(1.旋光法, 2 .折光法, 3.比重法,)2.物理化学法,(1.点位法, 2极普法, 3.光度法, 4.色谱法)3.化学方法,(1.斐林氏法. 2.高锰酸钾法. 3.碘量法. 4.铁氰化钾法. 5.蒽铜比色法. 6.咔唑比色法)共计三大种,在测定其他碳水化合物时,往往是使其水解为糖再进行测定。一. 总糖的测定食品中的总糖主要指具有还原性的葡萄糖,果糖,戊糖,乳糖和在测定条件下能水解为还原性的
8、单糖的蔗糖(水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖),麦芽糖(水解后为2分子葡萄糖)以及可能部分水解的淀粉(水解后为2分子葡萄糖)。还原糖类之所以具有还原性是由于分子中含有游离的醛基(-CHO)或酮基(=C=O)。测定总糖的经典化学方法都是以其能被各种试剂氧化为基础的。这些方法中,以各种根据斐林氏溶液的氧化作用的改进法的应用范围最广。在这里我们主要给大家介绍铁氰化钾法,蒽铜比色法,斐林氏容量法。斐林氏容量法由于反应复杂,影响因素较多,所以不如铁氰化钾法准确,但其操作简单迅速,试剂稳定,故被广泛采用。蒽铜比色法要求比色时糖液浓度在一定范围内,但要求检测液澄清,此外,在大多数情况下,测定要求不包括淀粉和
9、糊精,这就要在测定前将淀粉,糊精去掉,这样就使操作复杂化,限制了其广泛应用。(一) 铁氰化钾法1.原理:样品中原有的和水解后产生的转化糖都具有还原性质,在碱性溶液中能将铁氰化钾还原,根据铁氰化钾的浓度和检验滴定量可计算出含糖量。其反应为下:C6H12O6+6K3Fe(CN)6 + 6KOH (CHOH)4(COOH)2 + 6K4Fe(CN)6+ 4H2O滴定终了时,稍过量的转化糖即将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体。2,试剂1)1的次甲基兰指示剂2)盐酸(水解作用)3)10和30的NaOH溶液4)1铁氰化钾(贮存特色瓶,临用前标定)标定步骤称蔗糖1.0000g定容500ml取此液50ml于1
10、00ml容量瓶加hcl5ml摇匀65-70水裕15分钟取出冷却用30NaOH中和加水于刻度倒入滴定管中取10ml1铁氰化钾于锥形瓶中加10NaOH2.5ml加12.5ml的水加玻璃珠颗粒加热至沸保持一分钟加次甲基兰1滴立即以糖液滴足至蓝色退去为止,记录用量。正式滴定比较滴定时少0.5ml糖液,煮沸1分钟,加指示剂一滴,再用糖液滴定至兰色褪去,计算铁氰化钾溶液的浓度。A=(WV)/(10000.95)A:相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的量(克)V:滴定时消耗的糖液的体积W:称取纯蔗糖的量1000:稀释比0.95:换算等数3操作方法稀释10g用100ml水作溶液于250ml容量瓶加20醋酸铅1
11、0ml至沉淀完为止加10ml10NA2HPO4至不在产生沉淀为止加水至刻度过滤取滤液50ml于100ml容量瓶中按铁氰化钾标定法进行转化,中和及滴定计算糖含量总糖(以转化糖计%)= (A 1000)/(WV) 100 A:相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的重量,W:样品的重量V:滴定时样液消耗的体积4实验应注意(a)达终点时,过量的转化糖将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体,隐色体容量受空气中氧所氧化,很快又变成指示剂的颜色。(b)整个过程应在低温电炉上进行,滴定要速度,否则终点不明显(c)糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛,生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物,其颜色深浅与溶液中糖的浓度成正比,单
12、、双糖等糖类都直接于试剂发生作用,因此不需要水解。(二)蒽铜的比色法1.原理:糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛,生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物,其颜色深浅与溶液中糖的浓度成正比,可比色定量。2.试剂(1) 硫酸锌溶液:溶解500g化学纯硫酸锌于500ml水中(2) 亚铁氰化钾溶液:溶解10.6g化学纯亚铁氰化钾于100ml水中(3) 0.2蒽铜试剂:溶解蒽铜0.2g于100ml95硫酸中,置棕色瓶中冷暗处保存(4) 0.1葡萄糖液:准确称干燥葡萄糖0.1000g 定容100ml3.操作方法(1) 标准曲线绘制(2) 100ml容量瓶编号 沸水浴加热6分钟,取出冷却用1cm比色杯610nm测定
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