通过体外DNA改组技术获得新的植物强耐盐Na~+H~+逆向转运蛋白基因.doc
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1、通过体外DNA改组技术获得新的植物强耐盐Na+H+逆向转运蛋白基因【摘要】:土壤盐渍化是限制植物生长和降低农作物产量的一个重要的非生物胁迫因素。为了应对盐胁迫,植物通常采取一系列的适应调节机制,主要包括渗透调节和离子均衡等。植物通过液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+antiporter)将胞质过量Na+区隔化到液泡中,一方面可以降低胞质Na+浓度,另一方面还可以起到渗透调节的作用,促进细胞吸水,是一种经济有效的维持Na+均衡的方式。在不同植物中过量表达植物Na+/H+antiporter基因均显著提高了转基因植物的耐盐性,说明了植物液泡膜Na+/H+antiporter对植物耐盐起着
2、非常重要的作用。DNA改组(DNAShuffling)技术是目前对于蛋白质、酶和单克隆抗体等体外定向进化的快速高效的分子生物学方法,这一技术在提高酶活性、改变底物专一性和改善蛋白质(酶)的性能等方面具有广泛的应用前景。在实际生产应用上,目前在植物中已克隆的Na+/H+antiporter基因的Vmax相对较低,耐盐性不强,这很大程度上限制了该基因在作物分子育种中的应用。鉴于此,本课题利用DNAShuffling技术结合在酵母中异源表达改组基因文库以筛选获得活性显著提高、能耐受高浓度盐的新Na+/H+antiporter基因,同时对植物Na+/H+antiporter结构与功能的关系进行进一步的
3、研究。本研究论文总结如下:用DNase对AtNHX1进行随机片段化,回收其中100-200bp的小片段,通过无引物PCR使小片段重组,最后经PrimerPCR扩增得到含有重组AtNHX1片段的重组基因库。将扩增得到的含有重组AtNHX1片段连接到酵母表达载体pYPGE15中,利用乙酸锂技术转化酵母Na+/H+antiporter突变体W303ena1-4nhx1,构建表达重组基因库。将酵母转化子涂布在含100mMNaCl的APG选择性平板中进行高通量筛选,得到了一个盐耐受性显著提高的突变株,其中含有的改组Na+/H+antiporter基因我们命名为AtNHXS1。序列分析表明,AtNHXS1
4、较AtNHX1有7个核苷酸发生突变,并有42个核苷酸缺失,这个缺失造成了翻译的提前终止。AtNHXS1表达的蛋白含有4个氨基酸的突变,分别是L29P,S158P,Y241P和F242L,并在C末端有296个氨基酸的缺失。酵母功能互补试验显示,AtNHXS1表达的Na+/H+逆向转运蛋白较AtNHX1基因的表达产物耐NaCl能力提高了一倍。且表达AtNHXS1的酵母比表达AtNHX1的酵母中能富集更多的Na+和稍微多一些的K+。分别将GFP基因融合到AtNHX1和AtNHXS1的C末端,转入酵母中。激光共聚焦结果显示,AtNHXS1和AtNHX1表达的蛋白均定位于酵母液泡及液泡前极囊泡中。提取表
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