病理技术的新进展.doc
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1、病理技术的新进展放射自显影技术(autoradiograph)是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶(含AgBr或AgCl)的感光作用,对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布与代谢径路,包括定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素(如14C和3H)或放射性同位素标记的化合物导入生物体内(注入动物体内或加入培养基中),间隔一定时间取材,制成标本(如切片或涂片),在暗室中涂上液体原子核乳胶(卤化银乳胶),置暗处经一定时间的放射性曝光,组织中的放射性即可使乳胶感光。数日后再经显影、定影处理,
2、或经染色后光镜观察,在放射性同位素或其标记物存在的部位,溴化银被还原成黑色的微细银颗粒,即可得知标本中标记物的准确位置和数量,放射自显影的切片还可再用染料染色,这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。这种技术与电镜样品处理,则为电镜放射自显影术(electron microscope autoradiography)。 在生物学研究中,常用的放射性同位素主要是能量低、射程短、电离作用强的射线如3H,14C,32P,35S,125I,45Ca,等或其它化合物。放射自显影优点:定位精确,灵敏度高,分辨率好,能保存相当长时间;操作简便,无需复杂设备;可供定量研究和双同位素示踪
3、;将形态、机能和代谢地研究统一起来;研究某些大分子在体内地动态变化过程。 原位杂交原位杂交的概念原位杂交是用标记的核酸探针与细胞和组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的方法。即使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。分细胞原位杂交和组织切片原位杂交。原位杂交技术(In situ hybridization,ISH)是在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的,由分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术。原位杂交的发展简史ISH始于20世纪60年代。由于分子生物学技术的迅猛发展,特别是20世纪70年代末到80年代初,分子克隆、质粒和噬菌体DN
4、A的构建成功,为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。原位杂交的基本原理两条核苷酸单链片段,在适宜的条件下,能通过氢键结合,形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子,应用已知碱基序列并具有标记物的(有放射性同位素,如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质)RNA或DNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内的待测核酸互补配对,结合成专一的核酸杂交分子,通过标记物的显示(例如放射自显影等方法),在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件:组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、
5、有与探针结合的标记物。原位杂交的实践应用原位杂交技术可在原位研究和检测细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达,进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。随着相继建立的生物素和地高辛等非放射性标记技术,并结合应用免疫组织化学的显示技术,使原位杂交技术迅速推广应用于基础理论研究和临床诊断。如在肝炎病毒,肾综合征出血热病毒,人乳头瘤病毒,结核菌等检测中该法被迅速推广应用。由于其存在的不足,国外用微波加热技术进行改良,在节省杂交时间和蛋白酶K方面取得了良好的效果。经研究表明,微波加热的原位杂交可以取代普通原位杂交而用于石蜡标本的基因表达检测。目前在国内已逐步开展荧光标记原位杂交技术,能在荧光显微镜下
6、更加简便,清晰地观察结果。原位杂交的优点和缺点优点:(1)高特异性及灵敏性:抗原和抗体之间的特异识别及结合的特点,决定了荧光原位杂交的高度特异性,同时使检测的结果具有很高的灵感度;原位杂交技术因其高度的灵敏性和准确性而日益受到许多科研工作者的欢迎,并广泛应用到基因定位、性别鉴定和基因图谱的构建等研究领域。(2)结果直观:其结果在荧光显微镜下可直接观测。缺点:(1)费时:实验步骤较多,周期长;(2)成本高:蛋白酶K需要量大,所以成本较高。几种原位杂交技术1、基因组原位杂交技术基因组原位杂交(Genome in situ hybridization,GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种
7、原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异,用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻,在靶染色体上进行原位杂交。GISH技术最初应用于动物方面的研究。2、荧光原位杂交技术荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术是20世纪80年代末在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。FISH的基本原理是利用荧光标记(取代了同位素标记)的核酸片段为探针,将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检
8、测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。FISH技术检测时间短,检测灵敏度高、安全无污染、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点, 不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核。同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术,已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。3、多彩色荧光原位杂交技术多彩色荧光原位杂交(Multicolor fluorescence in situ hybridization,mFISH)是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术,它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交,
9、能同时检测多个靶位,各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同,呈现多种色彩,因而被称为多彩色荧光原位杂交。它克服了FISH技术的局限,能同时检测多个基因,在检测遗传物质的突变和染色体上基因定位等方面得到了广泛的应用。4、原位PCR原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合,即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加,然后通过原位杂交技术进行检测,从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。原位PCR技术大大提高了原位杂交技术的灵敏度和专一性,可用于低拷贝甚至单拷贝的基因定位,为原位杂交技术的发展提供了更广阔的发展前景。PCRPCR的概念: 聚合酶链式
10、反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种在体外由引物介导的DNA酶促合成反应,也叫基因扩增技术。是在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,即无细胞分子克隆技术。它的出现使人们对微量甚至单个细胞DNA的分析成为可能,并且表现出了前所未有的敏感性和特异性。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性,在离体条件下模仿细胞内DNA复制过程,用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促反应合成特异的DNA片段的体外方法。包括模板变性、引物退火和用DNA聚合酶延伸退火引物在内的重复循
11、环,使末端被引物5端限定的特异性片段成指数形式积累。这种由Mullis发现的方法最早被美国Cetus公司的人类遗传学部的一个小组用于球蛋白DNA的扩增及镰刀形红细胞贫血病的产前诊断。近十几年来,PCR技术得到了迅速发展,并日益完善,在医学生物科学研究的许多不同领域中简化了分析工作。该技术在分子生物学、医学、法医学、考古学等领域中都有重要的应用价值,并且对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展起到巨大的推动作用。PCR的基本原理:类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链,随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高使退火引
12、物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环,PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复,前一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板,目的DNA以2的指数方式积累,使皮克水平的起始物达到g数量级。PCR的应用:近2O年来,分子生物学突飞猛进,也开拓了分子病理学领域。分子病理学应用分子生物学一些基本技术,结合病理形态学的特点,将核酸原位分子杂交、聚合酶链反应(PCR)、核酸测序等应用于病理研究和诊断。PCR技术已广泛应用于分子生物学各个领域,并成为分子病理学的一个强有力的手段,被列为20世纪90年代生物学技术十大热点之首,已被广泛应用于分子克隆、DNA序列分析、癌相
13、关基因的检测、遗传病和分子病理诊断等多个领域。它不仅可用于基因的分离、克隆和核酸序列的分析,还可用于突变体、重组体的构建、基因表达调控研究、遗传病、传染病的诊断及肿瘤发生机理的探讨等。如应用PCR技术检测瘤细胞的基因重排诊断淋巴瘤,检测相关病毒、细菌等诊断结核、SARS等感染性疾病。荧光定量PCR技术利用荧光素标记探针,PCR扩增时会发出荧光,通过检测荧光的强度可实时(real time)监测PCR反应,定量准确,易于标准化。该技术解决了PCR产物的污染和PCR模板定量的问题,在临床观察患者病情发展及预后,判断药物疗效等方面的用途和前景十分广阔。在肿瘤细胞基因组DNA的PCR实验中,应用显微切
14、割技术在显微镜下将单个肿瘤细胞与正常组织细胞或瘤旁细胞中分离出来,避免非肿瘤细胞基因组DNA的干扰。新鲜组织和福尔马林固定石蜡包埋的病理组织切片或细胞涂片、培养细胞、血、痰液、乳汁和各种体液及尿液均可应用PCR技术进行DNA水平的相关研究。PCR技术的发展:RT-PCR,即 Reverse transcript反转录PCR。 原位PCR(In situ PCR)技术是继PCR技术之后又发展起来的一门新技术。是将PCR的高效扩增与原位杂交技术的细胞定位相结合,在组织切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行高效扩增再用特异性的探针作原位杂交检测。既能检出细胞内单拷贝及低拷贝的核酸序列,又能对
15、含靶序列的组织细胞进行形态学分析。极大提高了在细胞原位检测核酸及抗原的敏感性。原位逆转录PCR(In situ RT-PCR) 是将逆转录反应和PCR结合,检测细胞内低拷贝mRNA以mRNA为模板合成cDNA,再以cDNA为模板在DNA聚合酶作用下进行扩增,rTth逆转录酶具有分别依赖RNA或DNA的耐热I)NA聚合酶活性。可同时执行RT和PCR,使反应时间缩短。实时荧光定量PCR:开始阶段的PCR只局限于DNA的定性研究,随着科技的发展,定量PCR应运而生。然而,其精确性与特异性也不是绝对的,直到实时荧光定量PCR的出现,人们才真正实现了PCR从定性到定量的飞跃。 基本原理:聚合酶链式类似体
16、内的DNA复制过程,主要是利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特性,在一对引物诱发聚合酶反应。整个过程包括模板变性、模板与引物的结合和引物延伸3个步骤。而实时荧光定量PCR是在常规的PCR反应体系中加如入荧光标记探针,通过荧光信号积累实时检测整个PCR进程,来实现其定量功能。实践应用:实时荧光定量PCR在肿瘤学方面应用较广泛。(1)检测微量残渣疾病:目前血液肿瘤患者的高度复发是痊愈的一个主要障碍,而微量残渣疾病的检测是提供血液肿瘤患者有效治疗方案的关键一步,可以根据不同患者在分子水平的不同反应来指导个性化治疗;(2)检测单核苷酸多态性(SNP):单核苷酸是第3代遗传标记,即每一个核苷酸在任何一代人
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