栽培黑麦Waxy基因的克隆及序列分析+翻译文献.doc
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1、 学号:20090100292013 届本科生毕业论文(设计)题 目: 栽培黑麦Waxy基因的克隆及序列分析学院(系): 农 学 院专业年级: 农学09级学生姓名: 夏元燕指导教师: 陈其皎合作指导教师:完成日期: 二一三年六月目 录1 文献综述11.1 栽培黑麦的应用价值11.2黑麦基因资源在小麦育种中的研究现状及应用前景21.3籽粒淀粉合成与Waxy蛋白的关系研究31.4 Waxy蛋白研究状况41.5 Waxy基因的研究状况61.6 本实验的研究意义72 栽培黑麦Waxy基因的克隆92.1 材料与方法92.1.1 试验材料92.1.2试剂92.1.3 仪器92.2 试验方法102.2.1
2、引物设计与合成102.2.2黑麦基因组DNA的提取(微量CTAB法)102.2.3目的基因的扩增112.2.4目的片段的回收纯化112.2.5 目的片段的连接与质粒转化122.2.6 筛选阳性克隆122.2.7 核酸及蛋白序列分析133 结果与分析143.1 目的基因的扩增143.2 Waxy基因核酸序列分析143.3 Waxy蛋白序列及结构分析153.4 Waxy蛋白系统演化树的构建164 总结与讨论184.1实验总结184.2 讨论18参考文献19附 录21致 谢34栽培黑麦Waxy基因的克隆及序列分析作者:夏元燕 指导教师:陈其皎摘 要:淀粉是自然界含量最为丰富的碳水化合物之一,也是禾谷
3、类作物(小麦、大麦、玉米、水稻等)籽粒的主要能量储存物质。作为禾谷类作物籽粒和面粉的主要成分,组成淀粉的直链淀粉和支链淀粉的含量和其比例是影响面粉口味和加工品质的主要因素之一。在控制植物直链淀粉合成中,颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase, GBSS) 起着至关重要的作用,该酶也叫Waxy蛋白,由Waxy基因编码,与淀粉粒特异性结合后,指导直链淀粉的合成。当植物体内缺乏Waxy蛋白时,直链淀粉的合成就会受到阻碍,进而影响小麦籽粒中直链淀粉的最终含量。栽培黑麦(Secale cereale L.)是除小麦之外唯一适合做面包的谷类作物,作为栽培小麦的近亲
4、,对黑麦的研究历来受到重视。本研究利用微量CTAB法提取了5份栽培黑麦品种的基因组DNA,利用特异性引物进行PCR扩增,均得到了大小约2800bp的目的条带。NCBI在线BLAST表明,所得序列与黑麦品种Rogo的Waxy基因的编码序列具有95%的相似度。序列比对表明黑麦Waxy基因由11个外显子和10个内含子组成,去除内含子后,编码区长度为1815bp,编码604个氨基酸残基,序列比对表明编码区的同源性高达99%。将Waxy基因的编码区翻译成氨基酸后进行Motifscan在线预测,结果显示,Waxy蛋白的催化区由第78-339位共262个氨基酸残基组成,非催化区则分布在第379-516位氨基
5、酸残基。余下的第71-77位和517-604位氨基酸残基分别组成了Waxy蛋白的C-端非催化区和N-端非催化区。演化树的聚类分析表明,5条来源于黑麦的Waxy蛋白在氨基酸水平上与栽培大麦、野生二粒小麦和硬粒小麦遗传关系较为接近,与普通小麦、山羊草和大麦的遗传关系较远。关键词:黑麦;Waxy基因;克隆;序列分析CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF Waxy GENES FROM COMMON RYESABSTRACT: Starch is one of the most abundant carbohydrates in plant, it is also the m
6、ain storage material in cereal crop such as wheat, rice, maize, barley, rye and so on. As the main component in the grains and flour of cereal crops, the composition of starch, namely the content of amylase and amylopectin, is the major factor that determines the processing quality and flavor of flo
7、ur.In the controlling of amylose biosynthesis, granule-bound starch synthase plays a key role. This enzyme is also called Waxy protein, encoded by Waxy gene. After specifically binds with starch granules, Waxy protein can keep amylose unbranched. So amylose synthesis would be hampered when there is
8、a lack of Waxy protein in plant organ. And then, the final content of amylose is effected.Cultivated rye is the only grain crop capable to make bread besides wheat. As a close relative of wheat, rye is worth being studied in crop breeding and quality research.In this work, genomic DNA of five rye cu
9、ltivars was isolated. Target bands sized around 2800bp were amplified and sequenced through primer designing, PCR amplification and sequencing. Online BLAST indicated that the amplified sequences had a sequence identity of 95% with previously reported rye cultivar “Rogo”. Sequence alignment showed t
10、hat those cloned Waxy genes were constructed by 11 exons separated by 10 introns. The coding region of Waxy gene was 1815bp in length, encoding 604 amino acid residues. The coding regions of the five rye cultivars had 99% sequence identity. Online prediction of the amino acid sequences translated by
11、 the cloned Waxy genes indicated that the catalytic region of Waxy protein was constructed by the 78th to the 339th amino acid residues. And the none-catalytic region was from the 379th to the 516th amino acid residue sites. The rest amino acid residues of the 71st to the 77th sites and the 517th to
12、 the 604th sites form the N-none catalytic region and the C-none catalytic region, respectively.A phylogenic tree based on the translated amino acid sequences of the Waxy protein from the five rye cultivars shows that these rye cultivars had a closer evolutionary relationship with Triticum dicoccoid
13、es and Triticum durum, while evolutionary distances with Triticum aestivum, Aegilops searii and Hordeum Vulgare subsp.Spontaneum were a little farther.KEY WORDS: Secale cereale L., Waxy gene, cloning, sequence analysis栽培黑麦Waxy基因的克隆及序列分析1 文献综述黑麦(Secale cereale L.),别名粗麦、洋麦,黑麦属禾本科小麦族小麦亚族一年生或者越年生的草本植物,
14、染色体组为RR, 现存黑麦除了人工诱变的材料外 ,皆为二倍体, 体细胞染色体数多为2N=2X=141。对于黑麦属的分类一直存在着不同的观点,综合黑麦属分类历史和国内外各个专家学者的研究结果2-10,可将黑麦属分为4个种, 其中3个野生种, 即Secale vavilovii Grossh (瓦维洛夫黑麦 )、Secale sylvestre Host(森林黑麦)和Secale strictum L.(山地黑麦),1个栽培种 ,即Secale cereale L.(普通黑麦)。而且其中Secale cereale L.为一年生异花授粉作物类型,Secale vavilovii Grossh和Se
15、cale sylvestre Host为一年生自花授粉作物类型,Secale strictum L.为多年生异花授粉作物类型。黑麦起源于近东和地中海地区。1.1 栽培黑麦的应用价值(1) 黑麦具有非常发达的根系,因而也具有很好的抗性,黑麦是最早也是最成功地应用于改良小麦品质的近缘作物之一,黑麦属(Secale L.)是小麦的三级基因源(tertiary gene pool)11,它具有许多普通小麦所没有的优良性状,如抗病虫性(黑穗病、锈病、白粉病、甲虫、蚜虫等),抗逆性(耐旱、耐寒、耐盐碱、耐瘠薄、耐干热风等),抗倒伏,分蘖能力较强,大穗多小穗,赖氨酸含量较高,适应性广12等 ,若将这些优良性
16、状的基因导入到其它的作物中加以利用,如小麦,就大大拓宽了小麦的遗传基础,丰富了其遗传物质的多样性,所以黑麦可以作为一种优质的种质资源。(2) 除了小麦外,黑麦是唯一适合做面包的谷类作物,用黑麦磨成的面粉做面包或者面包添加剂,可以改善面包的风味与口味,提高面包的烘烤品质,但由于缺乏弹性,常同小麦面粉混合使用13,黑麦面粉作为面包添加剂制成的面包受到广大消费者的一致好评。(3) 黑麦也可以作为动物饲料和牧草,黑麦的叶量大、茎秆柔软、品质好、适口性强,是牛、马、羊、驴喜爱的优质饲草,尤其是奶牛更喜爱食。黑麦具有很高的绿肥价值,黑麦鲜草含氮、磷、钾比较高,而且随着生育进程含量逐渐下降,而粗纤维含量逐渐
17、升高,其中以冬前、越冬和返青期粗纤维的含量最高14,而且黑麦根系发达,一般产鲜根达1500-27000kg/hm2 ,以黑麦与豆科混播,可以提高土地和光能的利用率,从而生产更多的绿色有机体。在世界上,俄罗斯和乌克兰黑麦产量约占世界产量的1/3,其他主产国是波兰、德国、阿根廷、土耳其和美国15。黑麦也可用于制造酒精饮料。1.2黑麦基因资源在小麦育种中的研究现状及应用前景由于黑麦具有许多有育种价值的农艺性状,因此人们将一些黑麦材料的遗传物质导入到小麦中,育成携带有黑麦染色体或者黑麦染色体片段的小麦品种并得到了大面积的推广应用16,迄今为止,在黑麦全部基因组一共鉴定的抗白粉病主效的基因有49个,而且
18、命名的抗条锈病基因有30个17,但这些抗病基因在我国的小麦育种中还没有全部被成功利用。已经命名的这些抗小麦条锈病的基因位点中,有些来源普通小麦,有些来源小麦的近缘野生种属,如黑麦、山羊草、斯卑尔脱小麦、簇毛麦以及偃麦草,其中以来源于黑麦的Yr9在小麦育种工作中发挥着巨大的作用。在黑麦的染色体1R上携带有很多种优良的农艺性状基因和抗病虫基因,例如黑麦1R染色体上就含有抗锈病基因和抗白粉病基因,所以在近30年以来,1RS1BI易位系在世界范围内的小麦育种中发挥了特别重要的作用。上世纪70年代以来,我国成功引入了含抗条锈病基因Yr9的lBlR代换系牛朱特(Neuzucht)等。上世纪80年代初期发现
19、,在黑麦品种Prolific的6R染色体上有1个抗小麦白粉病的基因Pm20。Friebe等18获得了抗病材料“Ks93WGRC28”,它是将抗白粉病基因Pm20转移到易位染色体上。黑麦的6R染色体不但携带有抗白粉病基因,还含有抗条锈病的基因。张怀琼,任正隆19培育的981054系列证明了此结论。因此,6R和1R一样,在小麦育种中具有抗白粉病和抗条锈病的双重作用。张相岐等20通过花药离体培养培育的含有黑麦1对6R染色体的花粉株系M16对白粉病优势小种表现出高抗性,据此可以证明6R染色体上Pm20基因在小麦抗白粉病育种中的重要应用价值,同时也可以说明它是一个良好的异源抗源。黑麦优良的基因资源在小麦
20、育种工作过程中发挥着越来越重要的作用。舒焕麟等21选育出的小麦-黑麦染色体代换易位系NR98127-9S等小麦材料表现出高抗,而且此品种还可以作为四川地区小麦抗条锈病育种中的亲本加以利用。颜济等22利用一种黑麦材料作为外源基因培育出的小麦新种质10-A,其小穗数目高达3038个,且不分枝多小穗,这种小麦大大的提高了小麦的产量潜力。运用黑麦种质资源不仅仅能够拓宽小麦种质资源的遗传基础,丰富小麦种质资源遗传多样性,而且还能够在改良小麦的品质、抗病虫性等方面作出特别重要的贡献。目前研究表明黑麦的抗逆性,耐盐碱性以及耐瘠薄性等优良性状已在“龙饲0303饲用小黑麦”中得到了充分体现。所以可以预见,随着现
21、代生物技术和染色体工程的迅猛发展,将会有更多的黑麦优良性状被高效、准确地导入到栽培小麦的染色体中,极大限度的提高了栽培小麦的遗传基础,使其更多的应用在生产和生活之中。1.3籽粒淀粉合成与Waxy蛋白的关系研究淀粉主要被人类作为食物,同时也广泛地应用于食品加工业、饮料业、纺织和造纸等各个行业。它在我们的日常生活中扮演着越来越重要的角色,淀粉是由许多葡萄糖残基组成的多聚糖,因多聚糖链的长短和分支程度的不同而分为直链淀粉和支链淀粉两种类型,在作物胚乳中储藏的淀粉,一般由70%-80%的支链淀粉和20%-30%的直链淀粉组成23,谷类作物籽粒和面粉的主要成分就是淀粉,谷类作物食品的烘烤蒸煮品质除了与蛋
22、白质的数量和质量相关外,在很大程度上还受到淀粉性质的影响,即直链淀粉和支链淀粉的含量及其比例是影响面条蒸煮品质和口味的主要因素之一,直链淀粉含量较低的面粉,做成的面条具有较好的柔软度、光滑性和黏性等24-25。在籽粒淀粉合成过程中的酶主要有:(1)淀粉脱支酶(SBE) ;(2)酰苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase);(3)可溶性淀粉合成酶(SSS);(4)淀粉分支酶(DBE) ;(5)颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)。其中AGPase控制着淀粉的含量,AGPase大体上可以分成质体型与胞质型两种。对于大多数植物而言,该酶主要以质体型形式存在;而禾本科的胚乳则主要是胞质型AGPase。AGP
23、ase是一种寡聚酶,由两种结构不同的亚基组成(C2R2)。其中,小亚基的分子量介于50-55kDa,大亚基的分子量介于51-60kDa。氨基酸序列分析表明,在禾本科作物(如小麦、水稻、玉米、大麦等)的胚乳中,AGPase小亚基序列相似性超过了85,高于这些物种大亚基间的氨基酸的相似性。该现象说明,不同作物的AGPase大小亚基都具有保守性,但也存在进化上的差异。从功能的重要性上看,AGPase小亚基直接决定了淀粉的合成效率,其序列的变异也受到了比大亚基更为严格的控制。支链淀粉的合成受DBE、SSS和SBE三种酶共同控制,在SSS的催化下,ADPG中的葡萄糖基通过形成-1,4-糖苷键而与侧链的非
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