细胞细胞分裂,细胞周期.doc
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1、第19章 The Cell Cycle , DNA Replication and Mitosis一、 Mitosis(細胞分裂)細胞分裂是生物體生長和繁殖的基礎,由一個母細胞產生兩個或若干子細胞。原核細胞的分裂:細胞周期短,在適宜條件下可大量繁殖(如細菌每20分鐘就可分裂一次),其分裂方式為一分二或二分裂,習慣上又稱無絲分裂或直接分裂。真核生物的分裂:1. 有絲分裂不改變染色體的倍數。2. 減數分裂產生染色體倍數減半的生殖細胞,即配子,這是有性生殖的必要條件。 如果細胞分裂失去控制,會導致特定細胞團的增生、異常生長或腫瘤。嚴重的情況下發生惡性腫瘤,其中上皮組織來源的被稱為癌症。 Chroma
2、tin(染色質):DNA複合物和蛋白質構成真核細胞的染色體,主要蛋白質成分是組蛋白。主要功能是:1. 為適應在細胞內的大小,縮成更小的體積。2. 加強DNA,讓在有絲分裂的DNA不受損。3. 控制基因表達和DNA複製。 原核細胞的DNA稱為genophore染色體(無染色)。有三個層次的染色質組織:1. DNA環繞形成核小體組蛋白“beads on a string (珠字符串)”結構(euchromatin(常染色質))。2. 多組蛋白包裝成一個30 奈米纖維,組成核小體陣列中最緊湊的形式(heterochromatin(異染色質))。3. 更高級別的30奈米纖維的中期染色體在有絲分裂和減數
3、分裂過程中 DNA包裝。Chromosome(染色體):一捲曲DNA且含有許多基因、DNA結合蛋白質、調控元件和其他核苷酸序列。 中期真核細胞染色體的複製和濃縮。 (1)S期後的Chromatid(下方有解釋),具有兩個相同部分。 (2)Centromere的兩個染色單體觸摸,並在其微管附著。 (3)短臂。 (4)長的手臂。Chromatid(染色單體):存在染色體DNA內,細胞分裂的過程中,由一個著絲粒加入。 Mitotic spindle(有絲分裂的紡錘體):微管將姐妹染色體引導分開。Sister chromatids/Daughter chromosome (姐妹染色單體):這是兩個不同
4、的副本相同的染色體二倍體生物(如人類)的繼承,分別來自父母。包含相同的基因和相同的等位基因。姐妹染色單體的凝聚力:1. 修復受損的染色體之間的遺傳信息的正確分佈。2. 在S期中的缺陷可能導致非整倍體和癌症,特別是在檢查站(checkpoints)無法檢測到DNA損傷時會導致錯誤連接有絲分裂紡錘體。二、The cell cycle (細胞週期)間期:G1、S、G2期。M期:又稱有絲分裂,真核細胞將其細胞核中染色體分配到兩個子核之中的過程。早前期:兩個細胞核圓形物體是中心體,染色質正在凝聚。前期:摺疊後的染色體具有一對姐妹染色單體,兩染色單體之間以著絲粒相連。核膜裂解,微管進入核周圍並與相反極性微
5、管相互作用。中期:染色體在赤道板上排列。後期:姐妹染色單體分離為姊妹染色體末期:極性微管持續變長,細胞也隨之延長,對應的姊妹染色體分別被微管拉至細胞兩端。核膜前小膜泡在染色體表面結合併互相融合,逐漸形成完整核膜。染色體此時解旋成為染色質並被新核膜包裹。胞質分裂:高爾基體發出囊泡,將微管運輸至細胞中間,進而驅動細胞分裂成二。Interphas (間期)G1期:細胞周期中間期的一個階段,位於S期之前(9 hr)。1. 複製細胞器。2. 合成生長所需的糖、蛋白質和脂質,需要大量結構蛋白和酶。3. 大量合成蛋白質並提高代謝律。4. 受到生長因子、營養供應、溫度的限制。5. G1期暫停細胞周期,進入G0
6、期。6. 大部分哺乳動物細胞會進入G0期並在一些時刻重新進入S期。S期:細胞周期中DNA進行複製的時期。利用放射性標的(H3-thymidine)再用autoradiography*觀察S期的變化。G2期:細胞快速生長並大量合成有絲分裂所需蛋白質(4-6 hr)。 癌細胞可不經G2期而直接在DNA複製完成後進入有絲分裂。神經細胞與肌肉細胞不會再分裂。三、autoradiography (放射自顯影法)(一)原理將放射性核素標記的物質引入生物體或细胞,參與细胞的正常代谢過程,或連結到能與特異分子結合的探針上,利用放射性核素放出的射線去作用核子乳膠而顯像,從而達到對該放射性物質在組織或细胞内定位的
7、目的。1. 核子乳膠敏度,能精確地測定顯影顆粒的密度,離子射程和軌跡的擴散。2. 放射性核素放出的射線,在進行蛻變時主要放出三種射線,和射線。元素中有發射射線的核素如3H,32P,33P和35S等。(二)實驗方法 1. 放射性核素標記所要研究的大分子含有放射性核素,用來追蹤大分子物質 2. 樣品製備電鏡放射自顯影中的樣品製備過程與普通樣品製備技術相同。 3. 塗覆核子乳膠膜在帶有放射性核素的切片上覆蓋一層核子乳膠膜,然後進行自顯影過程。 4. 自顯影過程(曝光) 5. 顯影和定影 6. 基本實驗過程用大分子合成過程研究的放射自顯影技術: 同位素標記化合物注入動物體內取下器官或組織切片塗乳膠膜自
8、顯影顯影和定影染色觀察用於大分子定位研究的放射自顯影技術:組織固定包埋切片細胞化學反應塗乳膠膜自顯影顯影和定影染色觀察 同位素標記示踪化合物四、Flow cytometry application(流式細胞儀的應用)對懸液中的單細胞或其他生物粒子,通過檢測標記的螢光信號,逐一的細胞定量分析和分選的技術。可以檢測的參數:胞內抗原(各種細胞因子(cytokine)、次級媒介等)DNA(細胞周期分析、細胞動力學、細胞增殖等)染色體分析和分選(文庫構建、染色體塗染)細胞中的色素RNA細胞表面抗原(CD標記)細胞的體積和形態複雜程度蛋白質酵素活性細胞膜流動性細胞凋亡(apoptosis)監測細胞電通透性
9、流式細胞儀包括五個組成部分:1. 細胞流動系統:液流(鞘液(sheath fluid))攜帶細胞,使顆粒以串流形式通過光束。2. 光源:有通常的燈(汞或氙)、高功率水冷的雷射源(氬、氪、染料雷射)、低功率氣冷雷射(氬(488nm),紅氦氖(633nm),綠氦氖,氦鎘(紫外))、偶極雷射(藍、綠、紅、紫)。3. 檢測和模數轉換(analogue-to-digital conversion, ADC)系統:產生前散射、旁散射光和螢光的信號。4. 放大系統:線性或對數放大。5. 計算機:用於分析信號。癌細胞與牛樟芝結合。未加牛樟芝的癌細胞,G0/G1會減少,G2+M會增加。五、 Cell divis
10、ion(細胞分裂)1.CFSE染劑: (1)是一種可穿透細胞膜的螢光染料,具有與細胞特異性結合的琥珀醯亞胺脂基團和具有非 酶促水解作用的羥基螢光素二醋酸鹽基團,這使得CFSE成為一種良好的細胞標記物。 (2)具有細胞膜通透性:當CFSE以含有兩個乙酸基團和一個succinimidyl ester功能基團的 形式存在時,不具有熒光性質,而能夠自由進入細胞。 不具有膜通透性:而當其擴散進入細胞內環境,內源的酯酶可將其乙酸基團水解,此種 形式的CFSE分子具有很高的熒光活性,被激發能夠產生綠色熒光。 (3)當細胞進行分裂增殖時:具有熒光的胞質蛋白被平均分配到第二代細胞中,這樣與第一 代細胞相比,其熒
11、光強度便會減弱至一半;以此類推,分裂得到的第三代細胞的熒光強度 便會比第二代細胞再次減弱 。這種現象可以在488nm的激發光 下,採用流式細胞儀檢測分析,通過檢測到細胞螢光強度不斷的降低,進一步分析得出細胞分裂增殖的情況。2.有絲分裂(Mitosis):指細胞核中的染色體發生複製,進而生成兩個細胞核,最後分裂成兩個細胞的過程。在細胞週期中,有絲分裂與細胞質分裂(cytokinesis)同歸於有絲分裂期(M期)之內。有絲分裂生成的兩個子細胞中,含有與母細胞相同倍數的遺傳物質。包括: 間期,前期,前中期,中期,後期,末期。A.間期(Interphase):細胞核被核膜包圍住,且核仁可能會有兩個以上
12、在動物細胞中,每個中心體中含有兩個中心粒。有絲分裂則在細胞間期的早期,就是正複製一個染色體時,兩中心體就已經形成了。染色體在S phase已複製,還是鬆散的染色質,尚未可以分離。B.前期(Prophase):此時期細胞核內外都同時發生改變。細胞核中,核仁消失,染色體濃縮。細胞質中,兩中心體互相遠離,中間的纖維管拉長,形成初期的紡錘體。 Centrosome(中心粒): (1)與核相鄰接的粒狀物質(靠近核的非膜胞器組成(有9束三微管(93)(2)一個微管組織中心(microtubule organizing center):微管(microtubule)被連接及固定並進組裝的區域(如:中心體星體
13、、紡錘絲的形成、基體鞭毛、纖毛的形成)(3)在S phase期間被複製。(4)在有絲分裂或減數分裂過程中參與星射線(植物為紡綞絲)的形成。(5)決定在細胞分裂時的平面分離位置。中心粒C.前中期(Prometaphase):核膜消失,染色體更濃縮。1.細胞核外套膜的分裂2.紡錘絲微管黏接到centromere的染色體區域3. Kinetochore(著絲點):(1)為一多蛋白複合體,其位於中心粒區域(2)提供有絲分裂或減數分裂時的紡錘絲黏接位4. Centrosome(中心體):(1)為一重要的細胞器,結構上包括中心粒和中心體基質,作為細胞的微管組織中心,決定著細胞微管的極性、數目及分佈。(2)
14、由兩個次單位相黏。D.中期(Metaphase):染色體排列在距兩中心體等距的中期板上。1.當兩極的紡錘體微管分別同染色體的動粒結合,裝配成動粒微管之後,即進入中期。2.染色體在紡錘體動粒微管的作用下, 逐漸移向紡錘體的中心區, 稱為紡錘體赤道(spindle equator)。3.染色體移向赤道, 是紡錘體動粒微管相互作用的結果,並且是染色體由不穩定狀態向穩定狀態轉變的過程。E.後期(Anaphase):著絲點互相分離,而染色分體隨著紡錘絲往相反的位置移動。此時,細胞的兩極離的更遠,將細胞拉長。F.末期(Telophase cytokinesis):紡錘絲往兩極拉的力量更強,細胞更長。原本母
15、細胞中的核膜碎片,再次形成兩子細胞中的核膜。在動物細胞中,會產生分裂溝,把細胞擠成兩半核膜逐漸出現,染色體也恢復成鬆散的染色質。3.細胞週期(cell cycle):(1)M phase:進行有絲分裂的時期,是最短暫的一個週期。(2)interphase(間期):A.佔週期時間90%的間期,分為G1 phase,S phase,G2 phase三時期。a.GI phase:靜止期,細胞不作用b.S phase:DNA複製期c.G2 phase:細胞繼續生長,緊接著就是有絲分裂(M phase)的進行。B.在此時期,細胞會藉由合成蛋白質和產生原生質有機物來成長。4.centromere:(1)
16、centromere (中節):是染色體的一個位置。染色體結構中 P arm 與 q arm中間一段特別高度重複的DNA序列。一般衛星DNA就是來自此處的重複序列。(2) Kinetochore (著絲點):是一種蛋白質,專門辨認中節的 DNA 序列而結合的蛋白質,它可與紡綞絲的微管蛋白結合,故稱著絲點。(3)在染色體的中節 (centromere) 處,結合著絲點 (kinetochore) 蛋白,該蛋白可以固著紡綞絲,以牽引染色分體的分離。5.衛星DNA重複序列:為高度重複的短的DNA序列,不被轉錄,功能未詳,見於真核染色體中,局限於著絲點區域內。6.異染色質(heterochromati
17、n):染色體中的不活化區*是DNA內一種緊密組合的結構,轉錄作用在其中受到限制。*目前已知染色質有兩種類型:兩者差異最早是以受到染色之後的顏色深度來分辨,前者較淡,而後者,也就是異染色質則較深,可見其結構較為緊密(組蛋白包覆率及雙螺旋化的程度較較高)。A.真染色質B.異染色質:a.一般分佈於細胞核的邊緣地帶。b.多由不具遺傳活性的衛星序列(satellite sequences)所構成。c.其中的基因皆受到不同程度抑制,有些即使在真染色質內也無法表現。d.在細胞週期的S phase中,異染色質比真染色質更晚進行複製。e.只存在於真核生物中,著絲粒及端粒皆屬於異染色質;雌性體內去活化的X染色體(
18、也就是巴爾氏體)也是。f.造成基因的靜默機制,如histone的甲基化、siRNA通過RNAi時*siRNA:A.是長度20到25個核苷酸的雙股RNA。目前已知siRNA主要參與RNA干擾(RNAi)現象,以帶有專一性的方式調節基因的表達。此外,也參與一些與RNAi相關的反應途徑,例如抗病毒機制或是染色質結構的改變。不過這些複雜機制的反應途徑目前尚未明瞭。B.是植物中的後轉錄基因沉默(post-transcriptional gene silencing;PTGS)現象的一部分。發現合成的siRNA,可誘導哺乳動物體內的RNAi作用。這項發現引發了利用可控制的RNAi,來進行生物醫學研究與藥物
19、開發的方法。*RNA干擾:A.指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象,其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時,該mRNA發生降解而導致基因表達沉默。與其它基因沉默現象不同的是,在植物和線蟲中,RNAi具有傳遞性,可在細胞之間傳播,此現象被稱作系統性RNA干擾。B.RNAi與後轉錄基因沉默在分子層次上被證實是同一種現象。7.核型分析(Karyotype analysis):*當細胞處於有絲分裂中期時,染色體排列在細胞赤道板,是觀察它們的最好時機。*對這些細胞染色,通過顯微鏡拍照獲得它們的影像,根據它們的大小,條紋以及著絲
20、點所在的位置進行排列整合,就可以得到該細胞的染色體組型圖(在ppt的29頁)。*染色體組型圖並非染色體組型。從染色體組型圖中可以得出一個個體或者是遺傳群體的細胞染色體組型的情況。六、 分析方法:1.細胞分裂初期,染色體凝縮。通過染色,它們就可以通過顯微鏡去觀察使用秋水仙鹼去與細胞中的微管蛋白結合,抑制細胞分裂。2.通過顯微鏡拍照,將各個染色體的圖像剪出,根據上面提及的原則整理好,得到染色體組型圖。3.染色可以使得每條染色體上特徵條紋顯示出來,例如藉助FISH方法:通過 CCD相機(CCD=電荷耦合裝置)和電腦軟體的幫助,就可以分辨出顏色差異。通過這種技術,基因易位就可以被識別出來。這種技術還可
21、以用以確定標記染色體的組成。4.先將同源染色體配對,再根據它們的大小,著絲點的位置,明暗帶的位置。常染色體通常與性染色體分開排入7組並數字標記。*秋水仙素:A.將細胞內的微管中主要的成分微管蛋白黏合,阻止微管的聚合作用。B.抑制紡錘體的形成,阻止隨著細胞支架改變的有絲分裂。C.停止嗜中性球的活動能力。D.因為紡錘體無法形成,染色體不可能到達赤道板上,可引起純炎症或抗炎效用。F.運用於羊膜穿刺術。*FISH法:螢光原位雜交法A.原位雜交法(ISH)乃是利用實驗室中合成之DNA或RNA探針,去偵測組織內特定序列之DNA或RNA,以螢光標定之探針去進行原位雜交檢測,即稱為螢光原位雜交法Fluores
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