制备色谱应用sppt课件.ppt
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1、人们只有将新的天然产物纯化之后才能进一步利用谱学技术鉴定其化学结构,测定其理化性质和生物活性,同时提供其作为制药原料、标准品或供做合成工作的起始原料。从一个粗提物中获得纯的化合物通常需经过许多纯化步骤,这些步骤烦琐、耗时。且花费较大。有时,所需化合物得率很低或性质不稳,因而,需要有尽可能多的分离方法以供选择。尽管有时也可能犯这样或那样的错误,但今天人们已有可能通过对各种方法进行审慎地选择来设计一条恰当的快速分离路线。,Joumal of Chromatography Joumal of Liquid Chromatography and Related Technologies Analyti
2、cal Chemistry Natural Product Reports Phytoehemical Analysis LC-GC Magazine及其他各种专业杂志上 徐任生、陈仲良主编的中草药有效成分提取与分离,第二版,上海科学技术出版社,1983年,1989年第二次印刷) 植物成分分析,谭仁祥主编,,参考文献,第一章 样品的制备与纯化,样品的制备对于复杂的分离与纯化非常重要。恰当的样品预处理可免去后续操作过程中的许多麻烦,使分离纯化变得更为容易。无论样品是来源于混有蛋白质的生物体、生产中混有残存催化剂的工业制品,或混有干扰杂质的植物体,通过简单的预处理就可以除去其中大部分不需要的物质。
3、 样品的预处理特别适用于需要使用昂贵的制备型高压液相色谱柱时。尽管制备样品的目的不尽相同,但其中许多操作与分析型高压液相色谱中所采用的一样。当处理生物样品时问题可能更加复杂,因为样品不仅可能含有复杂的大分子,而且还可能混有前面纯化过程中残留的缓冲液、盐及洗涤剂。因此,必须在预处理中去除上述污染物以免污染高压液相色谱柱。 在设计纯化方案时,通常先使用高效与低分辨率的预处理方法,其中包括一些经典的方法,如选择性溶剂提取、过滤、沉淀、透析、离心及简单的常压柱色谱分离等。而一些较新的方法,如超临界流体萃取、固相萃取等则更具有快速、高效的优点。 生物分子(尤其是生物聚合体)与常见的次生代谢产物性质明显不
4、同,需要使用特殊的预处理方法。除常用的离心、沉淀(如用硫酸铵沉淀蛋白质)、离子交换及凝胶过滤等方法(Wehr,1990)外,可用透析、超滤等专用方法。,1中药化学成分概述 成分分类 生物碱 有机胺类 吡咯类 吡啶类 莨菪烷类 喹啉类 异喹啉类 菲啶类 丫啶酮类 吲哚类 咪唑类 喹唑酮类 嘌呤类 甾体类 帖类 大环类 其他类 苷类 黄酮苷 蒽醌苷 皂苷 强心苷 香豆精苷 挥发油 有机酸 蛋白质 氨基酸 树脂 糖类 鞣质,中药化学成分预试,一、样品的制备 取通过20目筛的中草药粉末5克,加入50毫升95乙醇,在水浴上回流加热10分钟。过滤,滤液浓缩至1/2量,得“乙醇提取液”备用,此提取液浓度为每
5、5毫升相当于1克生药。 二、操作方法 取直径125厘米的普通圆形滤纸(新华牌或其他牌号,要求质地较细)一张,滤纸中心处打一小孔、备插入滤纸芯之用,将O1毫升乙醇提取液仔细滴加在距纸中心约1厘米处(如图1所示)。,圆形滤纸层析预试法,一张圆滤纸可同时点上810个样品。样品滴好后,将一小条滤纸芯插入滤纸的中心小孔。移到盛有展开溶剂的直径为12厘米的培养皿中,滤纸芯浸在溶剂中,滤纸上再盖以同样直径的培养皿,以进行层析(如图2所示)。溶剂的前沿达到滤纸边缘后,取出滤纸,待溶剂挥发后,根据情况,喷上显色剂。 如果要测定不同样品中同类成分的分布情况,则可在一张圆形滤纸上分别滴加各种中药(最多可滴加10种)
6、的乙醇提取液,用溶剂展开后喷同一种显色剂。当欲观察一种样品中几种成分的分布情况,则可滴加10个同一种中药的乙醇提取液,经溶剂展开后,将滤纸剪为10份,分别喷以不同显色剂。,三、展开溶剂 以甲醇或95乙醇为展开溶剂。可采用重蒸馏的工业规格的溶剂。 四、显色剂 优点是节省原料、试剂和时间,还可以防止试管反应中由中药颜色造成的假阳性。,二试管预试法 1样品制备 (1)酸性乙醇提取液 称取通过20目的中药粉末10g,加70ml0.5%的盐酸乙醇溶液,在水浴上回流加热10min,趁热滤过,得酸性乙醇提取液。此滤液用以检查酚性成分、有机酸和生物碱。 (2)水提取液 称取通过20目的中药粉末10g,加水10
7、0ml,在室温浸泡过夜,滤取10ml滤液,供检查氨基酸、多肽和蛋白质等。剩余的药渣及浸液在60水浴中加热10min,立即过滤,此滤液供检查糖、多糖、皂苷、苷类和鞣质等。 (3)甲醇提取液 称取通过20目的中药粉末10g,加入70ml甲醇,在水浴上回流加热10min,趁热滤过,滤液供检查黄酮及其苷类、蒽醌及其苷类、强心苷、香豆精及其苷类、内酯、挥发油、植物甾醇和油脂类等。 (试管反应因中药颜色深,容易造成假阳性),中药化学成分系统预试法 1单项预试即直接寻找生物碱、苷、。 2系统预试法 常用递增极性溶剂法,系统预试流程图,中药粉末(6g干品或12g鲜品) 甲醇60ml,温浸过夜,滤过 中药残渣
8、滤液 回收甲醇 2%醋酸,15ml温浸20-3-min, 滤过 提取物 中药残渣 酸液 合并加醋酸调pH5-6,用乙醚:氯仿(1:1)提取3次 酸水液 乙醚:氯仿液 氢氧化铵碱化氯仿提 2%碳酸钠溶液提取 碱性水液 氯仿溶液 水液 乙醚氯仿液 盐酸中和浓缩 脱水回收溶剂 盐酸酸化 部分丁 部分丙 乙醚提取 3/4量 1/4量 乙醚液 水蒸气蒸馏 部分甲 水溶性成分(糖、蛋白 碱性成分(生物碱 脱水、回收 不挥发部分 馏出液 (中性成分) 质、皂苷、鞣质及其他 和其他胺类成分 部分乙 乙醚提取 乙醚提取 水、溶性高分子化合物、 酸性成分 部分甲b 部分甲a 各种亲水性苷、水溶性 (有机酸及其他酸
9、性成分)(中性非挥发性成分 中性挥发性成分 生物碱) 油脂、蜡、 树脂、甾萜、 酚类、 植物色素等),溶剂混溶性表,中药化学成分提取基本方法 21 提 取,合理地选择单一或混合溶剂进行提取是保证正确的样品制备的第一步。首先以低极性溶剂提取可得到亲脂性的组分,而用醇类溶剂提取则可得到大量的极性与非极性物质。若开始阶段采用极性大的溶剂提取,则接着可用溶剂分配方法将提取物分为极性不同的部位。 在提取操作的各种方法中,搅拌与机械振荡是常用的方法,此外还有渗滤或加压固液提取等手段。在加压固液提取法中,将干燥的植物装在柱中,用泵加压使提取溶剂通过柱床。Dionex公司生产的适用于该方法的一种提取装置ASE
10、 200(Accelerated Solvent Extraction),据称每次提取只需20min提取温度也可调至高达200,并可选择三种不同大小的提取器:11,22和33ml。尽管该仪器价格较高,却代表了提取技术方面的重要进步。 在蛋白质的纯化过程中,提取物的制备是关键的一步,其中有些需要特别注意之处,如有时可能需要加人缓冲溶液、洗涤剂、辅因子或其他一些试剂。,(1)溶剂法 水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿苯石油醚 冷浸 煎煮 回流 渗漉 连续抽提 (2)水蒸气蒸馏法 (3)升华法,2.2溶剂的极性 溶剂的极性可以大体根据介电常数()的大小来判断。常用溶剂的介电常数及其极性排列如表1-5所示
11、:,2.2.1 官能团的极性,(2) 化合物的极性则由分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合因素所决定。以氨基酸来说,分子结构中既有正电基团,又有负电基团,故极性很强。高级脂肪酸,如硬脂酸,虽也含有如羧基这样的强极性基团,但因分子的主体乃由长链烃基所组成,故极性依然很弱。又如葡萄糖,因分子中含有许多-OH基,故为极性化合物,但鼠李糖(6-去氧糖)及加拿大麻糖(2,6-去氧糖)因分子中CH20H及CHOH分别脱去氧变为CH3及CH2,故极性即随之降低。,再如,从黄花夹竹桃果仁中曾分出下列七种成分。(表1-4)。,其中,与黄夹次甙相比,黄夹甙A、B因为分子中多出2个glc,故极性要大得多,并
12、以甙A(R=CHO)甙B(R=CH3)。 五种黄夹次甙中,AD的结构差别仅在R不同,故极性大小即取决乎R的种类,并排成下列顺序: 次甙D(COOH)C(CH2OH)A(CHO)B(CH3) 又,单乙酰黄夹次甙B与黄夹次甙B比较,-OH变为OCOCH3,故极性还要降低。 综上,黄花夹竹桃中七种强心甙的极性将按下列顺序排列。甙A甙B次甙D次甙c次甙A次甙B单乙酰次甙B。 上述极性强弱顺序决定着这些化合物在硅胶上的吸附行为及柱层析时的洗脱规律。 应当强调指出,酸性、碱性及两性有机化合物的极性强弱及吸附行为主要由其存在状态(游离型或解离型)所决定,并受溶剂pH韵影响。以生物碱而言,游离型为非极性化合物
13、,易为活性炭所吸附,但解离型则不然,为极性化合物,不易为活性炭所吸附。因此实践中常可通过改变溶剂pH以改变酸性、碱性及两性化合物的存在状态,进而影啊其吸附或层离行为达到分离精制的目的。,2制备色谱用样品的制备与纯化 2.1 提取,水层 石油醚液 用氯仿或乙醚萃取 水层 氯仿或乙醚液 乙酸乙酯萃取 水层 乙酸乙酯液 正丁醇萃取 水层 正丁醇液,中药粉末 用乙醇提取,滤液,回收乙 醇,用水混悬,用石油醚萃取,乙醇浓度的影响 95%乙醇可提取生物碱、挥发油、树脂和叶绿素; 6070%的乙醇可提取苷类成分; 4050%的乙醇可提取强心苷和鞣质; 2030%的乙醇可提取蒽醌及其苷类成分; 水对植物细胞的
14、穿透力最强,因此用有机溶剂进行提取时一般可以先以水浸润干燥后再提取。 渗漉与加压固液提取 渗漉是不加热的连续抽提,缺点是溶剂用量大,回收费时,优点是不受热,溶剂可以套用。一般到无色或渗漉液体积相当于药材量的10倍时可停止渗漉。 加压固液提取 是将干燥的中药粉末装入柱中,用泵加压使提取溶剂通过柱床,Dionex公司ASE200型提取器,每次提取20min即可,提取温度也可调整到200其规格有11、22、33ml的。,一般提取分离情况有2种,即已知化学结构类型的成分和一无所知的成分。对于已知结构类型的成分可借助文献等设计分离方法。而对于无任何信息的中药,关键是先有疗效,然后跟踪分离。先做化学成分预
15、试,然后设计提取分离方法。 1各种试剂对化学成分的溶解度都不是绝对的,有相互夹带,需注意; 2有机溶剂的渗透性差,所以用有机溶剂提取前可先将中药用水润透,干燥后再用有机溶剂提取,效果会更好; 3中药水提液如处理不及时,因其中含糖、蛋白质等营养物质易发霉,为防止发霉,可加入少量甲苯、甲醛或氯仿等做防腐剂; 4用水渗漉时,有时室温较高,在渗漉过程中,中药会发酵,为防止发酵可用氯仿饱和的水进行渗漉;,提取过程中的几点经验及注意,5水提取和减压浓缩时产生大量泡沫,给提取和浓缩造成困难,通常可在蒸馏瓶上装一防泡球加以克服;如图2-2或改用旋转蒸发仪,薄膜蒸发,喷雾干燥,冷冻干燥等。 实验室可加入消泡剂,
16、如吐温、司盘、豆油;丁醇、戊醇等。 6提取苷类中药时为防止水解,可先将中药粉末加醇煮沸片刻,以杀酶保苷,在提取氰苷和蒽醌苷时尤需注意。也可蒸30min或50min,根据药材质地而定。或直接用醇等有机溶剂提取;(或用硫酸铵等无机盐盐析使酶沉淀除去,鲜中药低温烘干60以下,将生药粉末在低温下与等量的硫酸铵调成糊状,装入布袋,压汁,药渣用有机溶剂提取原生苷。) 7提取次生苷时则利用其酶的活性,自身酶水解。(中药粉末加等量水拌匀湿润后,在3040保持612h以上,进行发酵酶解,然后在正常提取分离(如狄戈辛和西地兰)。,2.3 溶剂分配 溶剂分配主要是根据待分离物质在不相混溶的两相中分配系数的不同得以分
17、离。是一种简便快捷的方法。在得到提取物之后,接着用溶剂分配可除去大量外来杂质,特别是在进行生物活性跟踪分离时可快速得到富含所需成分的部分。如用于从植物中寻找抗肿瘤成分,抗HIV的活性成分,生物碱成分,对紫杉醇的初步纯化等。 在从植物中寻找新的具有抑制HIV活性的化合物时,一以1:1的二氯甲烷与甲醇及甲醇相继提取植物材料时,对各部位进行溶剂分配。具体方法如下:将粗提物首先在己烷与10%水-甲醇之间进行分配,极性大的下层调至含水25%,用四氯化碳进行分配,上层加水至含水35%,用氯仿继续提取;当从水相中蒸除甲醇后,用乙酸乙酯对剩余水相进行萃取。在用上述方法对马来西亚藤黄科植物Calophyllum
18、 lanigerum进行研究时,植物中具有抗 HIV活性的物质集中于己烷与四氯化碳提取部位。对这两个部位进行进一步分离,得到一系列calanolides香豆素类物质。 Gustafson等(1992)用类似的溶剂分配法从大戟科萨摩亚植物Homalanthus nutans中分得一个极性相对较大的12-去氧巴豆醇(12-deoxyphorbol)酯类化合物Prostratin,并发现它可以抑制HIV-1的细胞杀伤作用。,Prostratin,从植物材料中分离皂苷时,用丁醇-水分配方法可使皂苷类成分富集于丁醇部位,从而起到初步的纯化作用。通常先将含皂苷的植物用石油醚或二氯甲烷脱脂,然后用甲醇等极性
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