77细菌遗传学与基因工程.ppt
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1、细菌遗传学与基因工程,第一节 DNA的重组和重组DNA技术 第二节重组DNA技术的基本操作程序 第三节 转座因子 第四节 文库构建与酵母双杂,第一节 DNA的重组和重组DNA技术,一、重组DNA技术发展史上的重大事件 二、重组DNA技术的主要内容或步骤 三、重组DNA技术的主要技术原理 1PCR 2核酸的凝胶电泳(Agarose Polyacrylamide) 3核酸的分子杂交技术 4基因的定点诱变(site-directed mutagenesis) 5. 限制性核酸内切酶“分子手术刀” 6DNA连接酶“分子缝合针” 7基因的载体“分子运输车” 8细菌的转化,Section 1 DNA re
2、combination,DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。 包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型,广泛存在于各类生物。 体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA,是基因工程中的关键步骤。,Section 1 Recombination DNA technical,一、 重组DNA技术发展史上的重大事件,40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题; 50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题; 50年代末至60年代,相继提出了“中心法则“和操纵子学说,成功地破译了遗传密
3、码,充分认识了遗传信息的流动和表达。,年份 事 件,1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。 1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实噬菌体的遗传物质是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合
4、酶和信使RNA,并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码;F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。,年份 事 件,1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人证明,多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定;科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒“DNA所决定。 1966 M.W.Nirenberg,S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。 1970 H.O.Smith
5、,K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 1972-1973 H.Boyer,P.Berg等人发展了DNA重组技术,于72年获得第一个重组DNA分子,73年完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体174基因组测定。,年份 事 件,1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 19
6、81 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠;A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。 1982 美、英批准使用第一例基因工程药物-胰岛素;Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 1983 获得第一例转基因植物。 1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。,年份 事 件,1986 GMO首次在环境中释放。 1988 J. D. Watson出任“人类基因组计划“首席科学家。 1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb) 1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。 1996 完成
7、了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。,二、重组DNA技术的主要内容或步骤,1. 从生物有机体基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段。 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上,形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称宿主细胞)并与之一起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中,筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞,并筛选出已经得到扩增的目的基因。 5. 将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之在新的遗传背景下实现功能表达,产生出人类所需要的物质。,三、重组DNA技
8、术的主要技术原理,1 PCR 穆里斯等人于1988年发明的,1993年获得了诺贝尔化学奖。在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 目的:获取大量的目的基因。 原理:DNA复制。 条件:已知目的基因的核苷酸序列即模板DNA、RNA引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)、离子。 方法:DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。 特点:指数扩增=2n(n为扩增循环的次数) 过程:变性、退火、延伸、重复四个过程。,重组DNA技术的 主要技术原理,1 PCR,重组DNA技术的主要技术原理,2 核酸的凝胶电泳(Agarose P
9、olyacrylamide) 电泳的速率,与电场强度成正比,与该分子所携带的净电荷数成正比,而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、极性、介质的粘度系数等)。 电泳的方向:DNA和RNA呈多聚阴离子状态(Polyanions)。将DNA、RNA放到电场中,它就会由负极正极移动。 染色:ethidium bromide染色,核酸分子在紫外光下发出荧光,肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。,重组DNA技术的主要技术原理,3核酸的分子杂交技术 核酸印迹(nucleic acid blotting)转移:将核酸样品转移到固体支持物滤膜上,主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and s
10、lot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting); 核酸杂交/印迹杂交:将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。,重组DNA技术的主要技术原理,4基因的定点诱变(site-directed mutagenesis) 基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程 a. 盒式诱变(cassette mutagenesis) b寡核苷酸引物诱变 c PCRG与PCR诱变,5限制性酶切-“分子手术刀” restrictionendonuclease:在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
11、型:既能催化宿主DNA的甲基化,又催化非甲基化的DNA的水解;型:只催化非甲基化的DNA的水解。,重组DNA技术的主要技术原理,4.36kp,5. 限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要来源:原核生物(300种原核生物中分离出了约4000种限制酶 ) 特点:具有专一性 作用:断裂特定部位两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 产物:用限制性核酸内切酶切割形成的末端有两种:即黏性末端和平末端。 黏性末端:是限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开形成的。 平末端:是限制酶在识别序列的中心轴线处切开形成的。,题. 下列关于基因工程中限制性核酸内切酶的描述,错误的是 A. 一种限制性核酸内切酶只能
12、识别一种特定的脱氧核苷酸序列 B. 限制性核酸内切酶的活性受温度影响 C. 限制性核酸内切酶能识别和切割RNA D. 限制性核酸内切酶可以从原核生物中提取,6DNA连接酶“分子缝合针” 作用:恢复被限制酶切开了的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。 种类 E.coli DNA连接酶:只能缝合双链DNA片段互补的黏性末端,而不能将双链DNA平末端进行连接。 T4 DNA连接酶:既可缝合DNA片段互补的黏性末端,又可缝合双链DNA片段的平末端。但连接平末端之间的效率比较低。,重组DNA技术的主要技术原理,6DNA连接酶“分子缝合针” DNA连接酶和DNA聚合酶的比较:,重组DNA技术的主要技术原理,7
13、基因的载体“分子运输车” 作用:是基因运输的工具:一是用它作为运载工具,将目的基因送到宿主细胞中去;二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 条件 能在宿主细胞内稳定保存并大量复制; 有一个至多个限制酶切点,以便与外源基因连接; 具有某些标记基因,以便进行筛选。,重组DNA技术的主要技术原理,7基因的载体“分子运输车” 种类: 目前,基因工程经常使用的载体主要有以下几类: 细菌的质粒:最常用的载体。 噬菌体 动植物病毒 它们来源不同,在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别,重组DNA技术的主要技术原理,8细菌的转化 一细菌菌株捕获另一细菌菌株的DNA,导致性状特征发生遗传改变
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