抗体制备技术.ppt
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1、抗体制备技术,1、多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb):用 一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物,可刺激 机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同 抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的 混合物。 2、单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAb):由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。,Ab1,Ab3,Ab4,单克隆抗体,Ab1,抗血清,Ab1 Ab2 Ab3 Ab4,Ab3,Ab4,普通抗血清(多克隆抗体),单克隆抗体和多克隆抗体产生区别示意图,抗体制备技术,一、多克隆抗体制备
2、 (一)免疫原的制备 (二)免疫动物 (三)免疫血清的纯化 (四)免疫血清的鉴定 (五)免疫血清的 二、单克隆抗体制备 (一)单克隆抗体制备原理,抗体制备技术,(二)单克隆抗体制备的技术要点 (三)影响杂交瘤技术的因素 (四)单克隆抗体的应用 三、基因工程抗体技术 (一)人源化抗体 (二)小分子抗体 (三)双特异性抗体 (四)抗体库技术,一、多克隆抗体制备,(一)免疫原的制备 免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫系 统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最 重要的性质是免疫原性(immunogenicity) 免疫原天然抗原、人工或合成抗原; 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原; 具体制备细胞
3、性抗原、可溶性抗原、半抗 原性抗原和免疫佐剂,1、细胞性抗原制备: 绵羊红细胞(SRBC)- 溶血素; 细菌- 抗菌抗体(动物免疫血清) 2、可溶性抗原制备: 指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需要由细胞的破碎、提取与纯化 1)细胞的破碎(物理法、化学法),2)提取与纯化: 超速离心分离是一种根据分离物质的比重特点,通过差速或梯度密度离心,将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法,只适宜少数大分子物质的分离。 选择性沉淀选择某抗原理化特性,采用相应沉淀剂或溶液环境例50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋;8%12%PEG 6000可沉淀IgG。,盐析法沉淀抗原的机理,超滤法利用孔径大小不同的特制薄
4、膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛 层析法包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析等,用于抗原等物质的精提 电泳(略) 3)鉴定: 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。,凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理,亲和层析的作用机理,3)鉴定: 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。 蛋白的含量定氮(紫外光280nm等) 分子的质量电泳、质谱 蛋白的纯度电泳、高效液相层析 免疫学活性免疫双扩散、免疫印迹,抗原性质分析结果,3、半抗原性免疫原的制备 半抗原(hapten) 蛋白质等载体(carrier) 连接物理法:即利用电荷和微孔吸附 半抗原 化学法:利用某些功能基团
5、把半 抗原连接到载体分子上,4、免疫佐剂(immunoadjuvant),佐剂 指某些物质,因为该类物质与抗原物质一起或先于注入机体,可增强机体对该抗原物质的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。 种类无机、生物性、人工合成、油剂和 纳米颗粒。 用途抗原表面积增,构型改变;延长抗 原的滞留时间;增强吞噬,(二)免疫动物,1、免疫动物的选择: 抗原来源与动物种属的关系(越近越差) 动物个体的选择(年龄、体重与健康,) 抗原性质与动物种类 2、免疫的方法: 免疫原的剂量 免疫的途径与其间隔时间 免疫动物采血 (对实验成功与否至关重要),(,(三)免疫血清的纯化,1、特异性抗体的纯化 1)亲和层析 2)
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