异常毕赤酵母(Pichia anomala) HN1--2菌株产单细胞蛋白和嗜杀因子的研究.pdf
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1、R * ¥女目4 ( P i c h t a m 口b ) H N I _ 2m # P 4 自自目镕目f “ R 异常毕赤酵母( P i c h i aa n o m a l a ) H N l 2 菌株产单细胞蛋白和 嗜杀因子的研究 摘要 红树林生态系统分布在全球1 j 2 个国家,总面积达到1 8 1 0 0 0K m 2 ,覆盖了 世界热带和亚热带6 0 7 5 的海岸线。中国现存的红树林约占世界红树林面积 的O1 。红树林中含有丰富的微生物资源,其中已分离鉴定出的真菌超过1 0 0 种,成为海洋真菌的第二大类群。本论文从红树林生态系统中分离得到一株同时 产单细胞蛋白和嗜杀因子的酵母萄
2、株H N l 2 ,通过传统方法和分子生物学方法的 鉴定,该菌株属于异常毕赤酵母,这是该现象的首次报道。 本论文以廉价的豆饼粉水解渡为基础,通过单因子优化的方法,对异常毕赤 酵母H N l 2 菌株液体发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀园子的条件进行了优化。最 终确定最佳培养基组成( w v ) 为:4O 豆饼粉水解液,3 0 葡萄糖。堆佳起始 p H 40 ,最佳接种量( v v ) 为8O ( O D 6 = 83 ) ,最佳培养温度2 8 。在5 一L 发酵罐中发酵时,该嗜杀菌株在1 2h 内即可产生大量的单细胞蛋白和嗜杀因子。 此时,菌体细胞的蛋白含量、生物量、还原糖含量以及透明圈直径分别达到
3、5 6O ( w w ) ,73g ,L ,95 9 L 和1 90N l m 。对发酵后菌体细胞的氨基酸组成进行分析 的结果显示苗体细胞中古有大量的必需氨基酸,如赖氨酸( 含量占总蛋白的 78 ) 、甲硫氢酸( 含量占总蛋白的18 ) 和亮氨酸( 含量占总蛋白的90 ) 。 以对虾肌肉蛋白为参考蛋白时,必需氨基酸指数( E A A I ) 为l0 4 ,属于优质蛋 白源。异常毕赤酵母H N 2 菌株分泌的嗜杀因子可以杀死长孢路德酵母、白色 假丝酵母、二尖梅奇酵母、季也蒙毕赤酵母、酒精酵母、解N I t I I 罗威亚酵母以及 海尼克鲁维酵母等自然界中广泛存在的多种酵母但对丝状真苗和细菌没有嗜
4、杀 衍性。通过与敏感野生菌林北培养的研究,发现异常毕赤酵母H N l 2 菌株在生 K 过程中可以防止野生菌株的污染,这在发酵工业中意义重大。 生产单细胞蛋白的种最要方法是固体发酵( S S F ) 。通过单因子优化的方 法,对以麦麸稻壳棍台物为基质的硎体发酵条件进行优化。最终确定最佳条件 为:罄质含水肇4 5 ( w w ) ,葡萄糖浓度I5 ( w w ) ,硫酸铵浓度为O3 ( w w ) ,p H 45 发酵温度2 8 ,发酵2 4h 后1 捌体混台物的平均蛋白含量由 异$ ¥卉B 日( P i c h l aa n o m a l a ) I N I2 自# 产$ 日虽自嗜糸日子的研
5、究 发酵前的1 42 3 ( W W ) 提高到2 97 8 ( w w ) ,透明圈直径达到1 01m m 。通 过固体发酵的方式提高混合物的蛋白含量,增加其饲用价值,这在畜牧业中具有 重要意义。 关键词:红树林:单细胞蛋白:嗜杀园子:固体发酵:异常毕赤酵母 异常毕赤酵日( P w h i aO M O m O O ) 洲I2 菌株产单细胞蛋白和嗜系目于的研究 R e s e a r c ho f s i m u l t a n e o u sp r o d u c t i o no f s i n g l ec e l lp r o t e i n a n dk i l l e rt o
6、x i nb yP i c h i aa n o m a l aH N l - 2 A b s t r a c t M a n g r o v ef o r e s t s ,w i t ht h et o t a la r e ab e i n g18 1 0 0 0K i n 2 ,a r ew i d e l yd i s t r i b u t e d i nI1 2c o u n t f i e sa n dc o v e r6 0 7 5 o fc o a s tl i n e so ft r o p i c a la n ds u b t r o p i c a l z o n
7、e sC h i n ah o s t s01 o ft h ew o r l dm a n g r o v ef o r e s t sM a n g r o v ef o r e s t sa r er i c hi n m i c r o o r g a n i s mr e s o u r c e sa n do v e r1 0 0f u n g a ls p e c i e sh a v eb e e ni n d e n t i f i e df r o m t h e s ee c o s y s t e m sU s i n gr o u n f i n ea n dm o
8、l e c u l a rm e t h o d s ,t h ey e a ts l r a i nt l N I 2t h a t c a np r o d u c eb e t hs i n g l ec e l lp r o t e i na n dk i g e rt o x i ni s o l a t e df r o mC h i n e s em a n g r o v e f o r e s t sw a si n d e m i f i e da saPa n o m a l as t r a i nT h i si st h ef i r s t r e p o r t
9、o fs u c h p h e n o m e n o n B a s e do nt h eo n ef a c t o ro p t i m i z a t i o nt h e o r y , c u l t u r a le o n d i t o n sf o rs i m u l t a n e o u s p r o d u c t i o no fS C Pa n dk i l l e rt o x i nb yPa ,t o t i $ a l as t r a i nH N I 一2w e r eo p t i m i z e dT h e b e s tc u l t
10、u r em e d i u mw a sf o u n dt ob ec o m p o s e do f40 ( w v ) o fs o y b e a nm e a l h y d r o l y s a t e a n d3 0 ( w v ) o f g l u c o s e T h eb e s t i n i t i a lp H ,b e s t i n o c u l u ms i z ea n db e s t f e n n e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew e r ef o u n dt ob e4 0 ,80 ( v v
11、) a n d2 8 ,r e s p e c t i v e l y W h e nt h ek i l l e ry e a s tc e l l sw e r eg r o w nb yb a t c hc u l t i v a t i o ni n5 - Lf e r m e n t o r , c r u d e p r o t e i ni nt h ec e l l s ,c e l lm a s s ,r e d u c i n gs u g a r a n dd i a m e t e ro ft h ei n h i b i t i o nz o n e r e a c
12、h e d5 60gp e r1 0 0go fc e l ld r yw e i g h t ,7 3gp e rl i t e r , 9 5gp e rl i t e r , a n d1 90 m n l r e s p e c t i v e l yw i t h i n 1 2ha n dt h i s y e a s ts y n t h e s i z e dal a r g ea m o u n to ft h e e s s e n t i a la m i n oa c i d s ,s u c ha sl y s i n e ( 78 ) ,m e t h i o n
13、i n e ( 18 ) ,a n dl e u c i n e ( 90 ) T h ec n t d ek i l l e rt o x i np r o d u c e db yt h ek i l l e ry e a s ti s o l a t eH N I 一2c o u l dk i l lt h ec e l l s o f L o d d e t o n w c e se l o n g i s p o r u s C a n d i d aa l b i c a n s M e t s c h n i k o u i ab i c u a L o i d a t a ,
14、P i c h i a g u d l i e r m o n d i iS a c c h a r o m y c ev e r c v i s i a eg a r r o i a | I ) I ) t i c 【lL l l l dK l u y v e l o m y c e s ( F Pv f f I “,i iw h i c ha r ew i d c l ? d i s l f i b e l e di nn a t u r a le n v i r o n m e n t slh er e s u l t sa l s o s h o w e dt h a tt h eu
15、n d e s ir a b l e ? c a s tc o u l db ea v o i d e dd ur i n gc e l lg r o l h0 1 “ t h ek i l l e r y e a s ta n dt h a ti sv e r yi m p o n a n li nt h n n e n t a t i o ni n d u s t r y 异$ $ 靠B 4 ( P t c h i aa n o m a l a ) 州12 自株P 4 胞噩自和嗜彖崮于的研究 O n eo f | h c m e t h o d 5 f o rS C Pp r o d u
16、c t i o n i ss o l i ds b | e f o r m e n t a t i o n ( S S F ) C u l t u r a c o n d i t o n sf o rS S Fw h e nw h e a tb r a na n dr i c e h u l lm i x t u r ew a su s e da st h es u b s t r a t e w e r eo p t i m i z e db a s e do no n ef a c t o ro p t i m i z a t i o nt h e o r y T h eb e s tc
17、u l t u r a lc o n d i t i o n s w e r ef o u n dt ob ea sf o l l o w s :S u b s t r a t em o i s t u r e4 5 ( w w ) ,g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n 15 ( w w ) ,( N H 4 ) 2 S 0 4c o n c e n t r a t i o n03 ( w w ) ,p H 45 ,f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e2 8 A f t e r2 4ho ff e r
18、 m e n t a t i o n ,t h ep r o t e i nc o n t e n tw a sr a i s e df l o m1 42 3 ( w w ) t o 2 97 8 ( w 们,a n d t h ed i a m e t e ro fc l e a rz o n e w a s l 0 Im m R a i s i n gp r o t e i nc o n t e n to f m i x t u r eu s i n gS S F m e t h o d m a y f i n d i t s f u t u r e i n A n i m a l H
19、u s b a n d r y K e y w o r d s :m a n g r o v ef o r e s t ;s i n g l e e e l l l p r o t e i n ;k i l l e r t o x i n ;s o l i ds t a t e f e r m e n t a t i o n :P i c h i aa n o m a l a 异常毕赤酵4 ( ,m a n o m Q k l 洲r 2 苗株产$ 目胞蛋自和口# 日子研究 目录 第一章绪论 红树林生态系统 I I 红树林生态系统简介 1 2 红树林生态系统在中国的分布 I 3 红树林生态系统中
20、的微生物资源 2 13 1 红树林生态系统中的细菌 2 13 2 红树林生态系统中的放线菌 3 I 3 3 红树林生态系统中的真菌 3 2 嗜系因子 2 】嗜系因子和嗜杀酵母简介 2 2 产嗜杀因子的真菌及其应用前景 2 2 】产嗜杀园子的真菌 4 2 22 嗜乐因予和嗜杀酵母的应用前景 6 2 3 嗜杀因子的性质 2 3 1 分子量 7 2 32 影响嗜杀因子作用的因素 7 24 嗜杀作用机理及检测方法 9 2 4 l 嗜杀因子受体 2 42 嗜杀因子对敏感细胞的作用 1 0 2 43 嗜杀因子检测方法 l l 3 单细胞蛋白 l l 3 1 单细胞蛋白简夼 l l 3 2 单细胞蛋白f l
21、 勺来源及生产单细胞蛋白的底物】2 33 单细胞蛋白的营养价值及其米源的限制因素 】5 33l 藻类的营养价值及其作为单细胞蛋白来源的限制 1 5 3 32 真菌的营养价值及其作为单细胞蛋白来源的限制 1 6 3 34 细菌的营养价值及其作为单细胞蛋白来源的限制 】7 3 4 单细胞蛋白生产的优化 1 8 4 本论文的研究内容和意义 1 9 第一章高蛋白含量同时产嗜系园子的菌株的筛选及鉴定 0 前言 2 1 1 材料与方法 2 l 菌种 2 1 t 2 培养肇2 0 试荆 2 1 2 】培养基 2 2 试剂 3 试验疗法 】3 l 高蛋白食量菌株的筛选 3 + 2 嚷杀活性的检测 2 1 2
22、2 2 3 2 3 2 4 异# # 寿辞Sf ,汹w 甜研删f j M 一2m 替P * 细胞噩白和镕呆目 的研究 l3 3 酵母菌种鉴定 2 4 2 结果与讨论 2 7 2l 高蛋白含量菌株的筛选结果 2 7 2 2 高蛋白含量菌株嘈杀活性的榆测 2 7 23 苗刊噬定结果 2 8 23 1 常规方法鉴定结果2 8 232 分予生物学方法鉴定结果 3 0 3 本章小结 3 2 第三章异常毕赤酵母H N I 2 菌株液体发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子的研究 0 前言 3 3 1 材料与方法 3 4 1l 菌种 3 4 2 培养基与试剂 3 4 1 2 1 培养基 3 4 1 22 试剂 3
23、4 3 试验方法 3 5 13 】粗蛋白含量的测定 3 5 13 2 生物量的测定 3 5 l33 嗜杀园子产量的检测 3 5 13 4 摇瓶发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀园子最佳条件的确定 3 5 l35 摇瓶发酵中菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径随时间的变化 3 7 13 6 在5 一L 发酵罐中发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子 3 7 13 7 还原糖含量的测定 3 7 3 8 总糖含量的测定 3 7 l39 氨基酸组成舶分析3 7 131 0 必需氨基酸指数( E A A I ) 的计算 3 8 2 结果与讨论 3 8 2l 摇瓶发酵同时产单细胞蛋白和嗜杀因子条件的优化 3 8 21 】豆饼
24、粉水解液浓度对菌体蛋白音量、生物量和透明圈直径的影响3 9 2l2N 酊l 浓度对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响3 9 2l3 不同碳源及其浓度对聋体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响4 0 214 不同起始p H 对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响4 2 215 培养温度对菌体蛋白含量、生物量和透明圈直径的影响 4 3 2l6 接种量对菌体蛋白含量、生物量和透n 月圈直径的影响 4 4 2 2 摇瓶发酵中菌体蛋白古量、c E 物量和透明圈直径随时问的变化 4 5 23 在5 L 发酵罐中发酵产单细胞蛋白和嗜杀因子 4 6 2 4 异常毕赤酵母H N l 一2 菌株细胞氨基酸组成
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