PDTC对LPS诱导急性肺损伤大鼠肺组织ICAM-1mRNA表 的调节作用1.doc
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1、精品论文 http:/ PDTC对LPS诱导急性肺损伤大鼠肺组织ICAM-1mRNA表 的调节作用1王大龙冷玉芳兰州大学第一医院麻醉科,兰州(730000)摘要:目的:探讨二硫代氨基吡咯烷 (pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)对内毒素(LPS)诱导急性肺损伤大鼠肺组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA 表达的影响及其可能 的保护机制。方法:72 只 Wista 大鼠随机分为三组:对照组(C 组 ),LPS 组(L 组),PDTC+LPS 组(P 组)。其中根据腹腔注射内毒素到取肺组织的时间分为 1、3、6、12h 亚组,每组六只。 观察大鼠肺组织病理变化
2、,肺组织湿/干重(W/D)比变化,同时使用 RT-PCR 法检测大鼠肺组 织 ICAM-1mRNA 表达。结果:与 C 组比,L 组大鼠腹腔注射内毒素后,肺组织 ICAM-1mRNA 表 达明显增强(P0.05),病理学显示肺组织结构破坏严重,肺组织湿 /干重比(W/D)明显 增大(P0.05)。与 L 组比,P 组应用 PDTC 后 ICAM-1mRNA 表达明显减少(P0.05),肺组 织结构的破坏有明显减轻,肺组织湿/干重比(W/D)明显减小(P0.05)。结论:应用 PDTC 能明显抑制 ICAM-1mRNA 表达,对 LPS 诱导急性肺损伤有一定保护作用。提示 PDTC 的肺保 护作
3、用机制可能与抑制 ICAM-1 的转录,进而抑制炎症反应有关。关键词:PDTC;核因子-B;ICAM-1;内毒素;肺损伤中图分类号:R655.31. 引 言:急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)是由严重感染、创伤和体克等多种病 因所致的弥漫性肺实质损伤,其在分子水平上表现为众多促炎性细胞因子、粘附分子的过 度表达,伴有多种炎症介质的产生。炎症形成级联反应,导致肺组织广泛损害,并累及诸 多肺外器官,其中,核因子 -B(NF-B)在调控炎症介质的基因表达上起着关键作用。 多种炎症介质基因的启动子和增强子中含有B 位点,如细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、白 细胞介素-1(IL-
4、1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-(TNF-)等。活化的 NF- B 可调控上述介质基因的表达 1,2。研究证明,抗氧化剂二硫代氨基吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)能够通过抑制重要的核转录因子-B(nuclearfactor-kappaB,NF- B)活化,减少致炎细胞因子表达与合成释放3.4 ,因此本实验建立大鼠内毒素性肺损伤模 型,研究 PDTC 对 LPS 诱导急性肺损伤大鼠肺组织 ICAM-1mRNA 影响,以探讨 PDTC 肺损伤的 保护作用及其机制。1 本课题得到甘肃省基础研究计划资助(0710RJZA038 )- 7 -精品
5、论文2. 材料与方法2.1材料实验动物及主要试剂: Wista 大鼠(由兰州大学医学院实验动物中心提供) 72 只,雌 雄各半,200250g,LPS(EColi055:B5)购自 sigma 公司,PDTC 购自 sigma 公司,核酸提 取试剂购自百泰克,RNA 试剂盒购自 Fermentas 公司。72 只 Wista 大鼠随机分为三组:对照组( C 组),LPS 组(L 组),PDTC+LPS 组(P 组)。 其中根据腹腔注射内毒素到取肺组织的时间分为 1、3、6、12h 亚组,每组六只。L 组和 P 组采用腹腔注射 LPS8mg/kg(5mg/ml)制作内毒素性肺损伤模型,C 组注射
6、同体积的生理盐 水。P 组在腹腔注射内毒素前 30min,尾静脉注射 PDTC120mg/kg(60mg/ml),L 组和 C 组 给予同体积的生理盐水。按分组规定的时间点,10水合氯醛 350mg/kg 腹腔注射麻醉,开 胸心脏放血处死,采集标本。2.2方法221RT-PCR 检测用 PCR 专用器械迅速取右肺下叶,经预冷的 DEPC 水冲洗表面的血液后立即置于液氮中 速冻,-80冰箱保存,待用于 RT-PCR。用 RNA 提取试剂 Trizol 提取肺组织总 RNA,反转 录合成 cDNA 第一条链。取反转录产物 2l 进行 PCR 反应(94变性 5min,59复性 30s,72延伸 1
7、min,35 个循环)。扩增组织中 ICAM-1 的引物为:5-AGGTATCCATCCATCCCACA-3和 5-AGTGTCTCATTCCCACGGAG-3,片段长度为 388bp;扩增内对照-actin 的引物为: -actin 引物 5-GTGGGCCGCTGTAGGCACCAA-3和 5-CTCTTTGATGTCGCACGATTTC-3,片 段长度为 540bp。由上海赛百盛有限公司合成。PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙 锭染色显示,凝胶图像分析系统分析,以 ICAM-1mRNA/-actinmRNA 电泳带的荧光强度比 值作为 ICAM-1mRNA 的表达量指标。22
8、2肺组织病理检查取左肺下叶,4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,HE 染色后光镜下观察肺组织形态学变化。223 肺组织湿/干重比值(W/D)取左肺下叶,滤纸拭去表面血液,称湿重后(W)置于 80烤箱烘烤 48 小时使肺组织 达恒重后称干重(D),计算 W/D 比值,224 统计学处理采用 SPSS11.0 软件进行统计学分析,计量资料以均数标准差( x s)表示。统计 分析采用单因素方差分析(ANOVA),P0.05 为差异有统计学意义。3. 结果31RT-PCR 检测 ICAM-1mRNA 表达结果C组大鼠肺组中ICAM-mRNA只有少量表达;L组ICAM-1mRNA表达量从注射内毒素后1h就开
9、始显著增加,与C组有差异(P0.05),直到12h达到高峰;在P组,ICAM-mRNA随时间的变化规律与L组相同,但是应用PDTC后能明显的抑制内毒素引起的ICAM-1mRNA的表达。与L组相比,P组在1、3、6、12h四个时间点ICAM-1mRNA的表达量都显著的降低(P0.05)。见表1、 图1。表 1 各组肺组织中 ICAM-mRNA 的表达水平比较(n=6, x s)组别1h3h6h12hC组L组P组0.400.0180.720.028*0.520.023*0.410.0260.920.023*0.650.037*0.390.0191.020.054*0.730.032*0.410.0
10、201.120.039*0.810.020*与 C 组相比,*P0.05;同一时间点与 L 组相比,P0.05图 1 各组肺组织中 ICAM-mRNA 的表达水平1,2为C组;3,4,5,6分别为LPS1h、3h、6h、12h组;7,8,9,10分别为PDTC+LPS1h、3h、6h、12h组。32肺组织光镜病理学结果C组在光镜可见肺泡结构完整,肺泡壁无水肿,无炎症细胞浸润;L组可见片状出血, 光镜下可见基本上看不到完整的肺泡结构,肺间质有严重的水肿、淤血,大量的炎症细胞 浸润;P组,肺泡结构受到轻微破坏,能看到代偿增大的肺泡,无明显的水肿、淤血,仅有 少量的炎症细胞浸润。见图2。图.2 各组
11、腹腔注射内毒素 6 小时后病理(HE200)33 肺组织湿/干重比值(W/D)与C组相比,P组和L组W/D比值在相同时间点均明显升高(P0.05),与L组相比P组, W/D比值在相同时间点均明显降低(P0.05)。有统计学意义。表1 各组肺组织中W/D比值( x s,n=6)组别1h3h6h12hC组L组P组4.270.164.610.08*4.360.10*4.260.114.830.12*4.560.24*4.250.205.220.14*4.830.16*4.260.235.750.27*5.240.38*与 C 组相比,*P0.05;同一时间点与 L 组相比,P0.054. 讨论在AL
12、I时,影响肺血管内皮细胞的有害物质可破坏内皮细胞的完整性,诱导其血液动力 学和血液流变学的改变,促进肺内皮细胞与循环血细胞的相互作用,导致血管通透性增加, 肺水肿形成。因此,肺血管内皮细胞损伤的评估较为重要,而其释放的粘附分子是损伤活 化的标志物,肺组织W/D的变化可以很好的反映肺泡血管的通透性及肺间质的改变程度。LPS 主要与巨噬细胞表面的Toll受体结合,启动胞内信号传递链,促进 IB亚型的降解并活 化NF-B的DNA结合能力,启动基因转录,表达和释放多种细胞因子,发挥其毒性作用5,6,7。 本研究中,L组注射LPS后,大鼠呼吸加快,肺组织的 ICAM-mRNA表达增强,W/D增加,并且
13、光镜观察到明显的肺损伤的形态学变化,证明了成功的建立了ALI模型。ICAM-1 是一类大分子糖蛋白,属于免疫球蛋白基因超家族,可以表达于多种类型的细 胞,它通过介导细胞与细胞间,细胞与细胞外基质间的粘附作用,参与一系列生理及病理 过程8。目前的研究认为大量的多形核白细胞(PMN)黏附于肺血管内皮细胞、在肺内扣押 并释放生物活性介质是 ALI 发生的主要机制之一;通过有效的减少或清除肺内的 PMN 而控 制炎症反应,可以减轻 ALI9。ICAM-1 在肺组织中的表达增强 ,一方面通过与其配体即表达 于 PMN 表面的 CD11/CD18 相结合有助于 PMN 与血管内皮细胞相黏附 ,促使 PMN
14、 移行于血 管外;另一方面 PMN 与靶细胞黏附结合后 ,形成了 PMN 与靶细胞之间的一个较紧密且相对稳 定的微环境 ,此微环境有利于 PMN 释放的毒性介质在局部保持较高浓度 ,从而对靶细胞发 挥有效的毒性作用,进而导致肺实质细胞损伤及持续细胞因子释放 10。本研究中,与 C 组 比较,L 组的 ICAM-1mRNA 表达增加,光镜下可见肺泡结构基本消失,肺间质淤血水肿,肺 组织间隙有大量的 PMN 聚集扣押,表明在 LPS 的刺激下,大量激活的 PMN 向肺组织转移, 聚集在肺组织并激活,继而产生肺损伤。同时 ICAM-1mRNA 表达随时间变化增强,炎症反应 加重。ICAM 的表达受到
15、多条信号传导通路的调控。目前研究认为 ICAM-1 的表达可能与 NF- B 的活化有关。NF-B 是一种细胞内普遍存在的转录因子,具有和某些基因启动子区固定 核苷酸序列结合而启动基因转录的功能;正常情况下,与其抑制物 IB 结合,存在于静止期细胞的胞浆中。已证实,ICAM-1 基因启动子上含有 NF-B 结合位点,各种细胞外的刺激信号使胞浆中未活化的 NF-B 激活进入胞核,促进其细胞粘附分子的表达;细胞粘附分子又可反过来进一步活化 NF-B,由此形成一个反馈调节,使炎症不断放大。NF-B 诱导 ICAM-1 表达和增强 PMN 粘附的作用已通过很多试验证实11、12。研究证明,PDTC 是
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