41BBL介导的逆向信号对人外周血T细胞体外活化的调节作用.pdf
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1、. 基 础 免疫 学 . 4 - 1 B B L 介导的逆向信号对人外周血T 细胞 体外活化的调节作用 居颂文 居颂光 仇红霞 王凤鸣 王明元 胡玉敏刘彤刘高勤张学光 【 摘要 】 目的 探讨表达于活化T 细胞上的4 - I B B L 分子对T 细胞的调节作用及可能机制。方 法鼠 抗人4 - 1 B B L 单克隆抗体1 F 1 加人C D 3 单抗联合C D 2 8 单抗激发的T 细胞培养体系。细胞计数 分析T 细胞的增殖; P U A n n e x i n V双染法分析T 细胞的凋亡; E I I S A法测定培养上清中细胞因子的分 泌水平; 流式细胞仪分析T 细胞的表型。结果 单抗
2、1 F 1 能够有效地抑制活化T 细胞的体外增殖并 诱导其凋亡, 同时单抗1 F 1 还可抑制活化T 细胞分泌I I r 2 和I F N - y 及上调T 细胞表面C D 9 5 和P D - 1 分 子的表达。 结论在T 细胞活化过程中, 活化T 细胞表达的4 - I B B L 分子通过逆向信号抑制其细胞因 子的分泌和上调负性调控分子, 进而抑制T 细胞的过度活化和下调T 细胞介导的免疫应答。 【 关键词 4 - 1 B B L ; 逆向 信号; 共刺激分子; T 细胞活化 T h e r e v e r s e s i g n a l m e d i a ti o n o f r e
3、g u l a t e s a c ti v a t i o n o f h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d T c e ll 勿 4 - I B B L i n v i t a J U S o n g - u ie n , J U S o n g - g u - n g , 必U H o n g - x ia , W A N G F e n g - m i n g , W A N G M i n g - y u a n , H U Y u - n u n , L I U T o n g , L I U G a o- g m, Z H A N G X
4、 n e - g u a n g . M e d ic a l B io t e c h n o lo g y I n s t i t u t e of S o o c h o w U n i v e r s i t y , S u z h o u 2 1 5 0 0 7 , C h i n a C o r r e s p o n d in g a u th o r : Z H A N G X u e - g u a n g , E n w il : s m b x u e g z p u b l ic . s z . c n 【 A b s t r a c t 】O b j e c ti v
5、 e T o a n a ly z e t h e r o l e o f 4 1 B B L , e x p re s s e d i n t h e re g u la t io n o f h u m a n p e ri p h e r a l b lo o d T c e ll a c ti v a t io n . M e t h o d s A p o p to ti c T c e l ls w e re e v a lu a t e d 坊p r o p i d i u m io d id e u p t a k e a n d A n n e x in V b in d i
6、 n g . C y to k in e c o n c e n t r a t io n s in s u p e r n a t a n t s w e re d e t e r m i n e d 场E L L S A . P h e n o ty p ic a n a ly s e s w e re p e r fo r m e d w i t h d i r e c t i m m u n o fl u o r e s c e n c e t e c h n i q u e s i n a F A C S . R e s u l t s M c A b 1 F 1 i n h i b
7、 i t e d T c e ll p r o l i f e r a t i o n a n d i n - d u c e d T c e ll s a p o p t o s i s . I n a d d i t io n , M c A b 1 F 1 s u p p re s s e d t h e s e c re t io n o f II r 2 a n d I F N - y , a n d u p re 酗a t e d t h e e x p re s s io n o f C D 9 5 a n d P D - 1 . C o n c l u s io n 4 1 B
8、 B L re v e r s e s ig n a l p re v e n t T c e ll a c t iv a ti o n a n d d o w n r e g u l a t e i m - m u n e re s p o n s e s m e d i a t e d 场T c e ll v i a i n h i b i t i n g s e c re t i o n o f c y t o ld n e s a n d u p re g u l a t i n g n e g a ti v e c o s t i m u l a t o ry m o l - e c
9、 u l e . 【 K e y w o r d s 】4 - 1 B B L ; R e v e rs e s ig n a l ; C o s t im u l a t o ry m o l e c u le ; T c e ll a c ti v a t io n 4 - 1 B B L ( 4 - 1 B B L ig a n d ) 分子为共刺激分子T N F 家族的重要成员, 表达于活化的B细胞、 单核细胞、 树突状细胞等, 其受体4 - 1 B B 可诱导性表达于活化 早期的T 细胞表面“ ) a 4 - 1 B B L / 4 - 1 B B 结合产生共刺 激信号, 能协同C
10、D 2 8 信号进一步促进T 细胞的活 化、 增殖和功能的 介导(2 ) 。 新近的 研究表明: 4 - 1 B B L 还 表 达于 活 化的T 细胞 表面。 S c h w a rz 等(3 ) 报道, 利 用4 - 1 B B 转基因细胞或4 - 1 B B - F c 融合蛋白刺激活化 T 细胞表面的4 - 1 B B L 分子, 能够抑制其增殖, 但是 具体的机制目 前尚未阐明。本实验利用本单位研制 的抗人4 - 1 B B L 功能性单抗1 F 1 14 ) 对活化T 细胞表达 4 - 1 B B L 分子的生物学功能及其调节机制作了进一 步的探讨。 材料和方法 基金项目: 国家自
11、然基金青年科学基金项目( 3 0 4 0 0 3 9 4 ) ; 江苏省 教育厅博士生创新计划( 5 0 3 2 0 0 2 5 ) 作者单位: 2 1 5 0 0 7 苏州大学医学生物技术研究所, 苏州大学附属 第一人民医院临床免疫实验室 通 讯作者: 张学光, E m a i l : s m b x u e g z p u b li c l . s z . c n , 电话: 0 5 1 2 - 6 5 1 2 5 0 1 1 材料: 胎牛血清( F C S ) 购自 美国H y c lo n e 公司; R P M I 1 6 4 ( ) 培养基购自 美国G I B C O公司; 淋巴细
12、胞 分离液购自中国上海试剂二厂; 包被羊抗鼠二抗的 免疫磁珠、 激发型C D 3 单抗、 a n t i - P D - 1 - P E 直标单抗、 a n t i- C D 9 5 - P E 直标单抗及A n n e x in V 试剂盒( 内含P I 染液) 购自 法国I m tn u n o t e c h 公司; a n t i - 4 - 1 B B L - P E 直 标 单抗购自 美国P h a r n ti n g e n 公司; 4 - 1 B B L 单抗1 F 1 及激发型C D 2 8 单抗1 0 ”为本单位研制(, 气I L - 2 和 I F N - y E L
13、I S A试剂盒购自 美国R 2 4 孔培养 板购自 丹麦N u n c 公司; 酶标仪购自 美国B i o - R a d 公 司; 流式细胞仪购自 美国C o u l t e r 公司。 外周血T淋巴细胞的制备: 取3 个健康志愿者 全血, 采用F i c o ll 淋巴细胞分离法, 获得外周血单个 中 华 微 生 物 学 和 免疫 学杂 志2 0 0 6 年2 月 第2 6 卷 第2 期 C h in J M ic ro b io l I rn m u n o l , F e b r u a r y 2 0 0 6 , V o l 2 6 , N o . 2 核细胞, 继而采用免疫磁珠结
14、合的抗人C D 1 9 , C D 5 6 和C D 1 4 单抗阴性选择法( 按说明书进行操作) , 去 除C D 1 9 , C D 5 6 和C D 1 4 阳性细胞, 富集T 细胞。 T 细胞体外活化前后4 - 1 B B L 表达的改变: 激发 型C D 3 单抗( 用p H 7 . 4 的P B S 调整至抗体浓度为 1 澎m l ) 包被2 4 孔板, 每孔加3 0 0 1, 1 , 4 过夜, 吸去 上清, P B S 洗涤2 次。 对照组包被小鼠I g G 1 同型对 照抗体。用含 1 0 % F C S 的B P M I 1 6 4 0 培养基将T细 胞调整为3 x 1 0
15、 5 个/ r n l , 接种于该 2 4 孔板, C D 2 8 单 抗1 0 ”按 终 浓 度1 p g / m l 加人实 验组, 总培养体积 为1 m l/ 孔, 同时设小鼠I g G I 对照组。3 7 T, 5 % C O Z 培养3 d , 收集活化 T 细胞及静止T 细胞, 采用 a n t i - 4 - 1 B B L - P E 标记细胞, F R C S 分析4 - 1 B B L 分子在活化 T 细胞及静止 T细胞上的表达。 T细胞活化的体外抑制实验: 激发型 C D 3 单抗 和4 - 1 B B L 单抗1 F 1 混合( 用p H 7 . 4 的P B S 调
16、整至抗 体浓度均为1 p g / r n l ) , 按3 0 0 川 / 孔, 共同 包被2 4 孔 板, 4 过夜后弃包被液, P B S 洗 2 次。对照组包被 C D 3 单抗和小鼠I g G 1 。用含1 0 % F C S 的R P M I 1 6 4 0 将T 细胞浓度调整为 3 x 1 0 5 个/ m l , 接种于该 2 4 孔 板, C D 2 8 单抗I O F 3 按终浓度1 留m l 加人实验组及 对照组, 总培养体积为 I m l / 孔。3 7 t, 5 % C O , 培 养, 分别在 1 , 2 和3d 收集细胞, 进行细胞计数, 同 时收集上清, E L
17、I S A法测定上清中M - 2 和I F N - y 的 含 量。 收 集 第3 天的 细 胞标记a n t i - C D 9 5 - P E 和a n t i- P D - 1 - P E , F A C S 分析表型及 P I / A n n e x i n V双染法( 按 说明书进行操作) 分析T 细胞的凋亡。 统计学方法: 所获得的数据采用S P S S 1 0 . 0 统计 软件分析。P 0 . 0 5 , # P 0 . 0 5 , # P 0 . 0 5 , # P 0 . 0 5 , # P 0 . 0 5 4 . 4 - 1 B B L逆向信号上调 C D 9 5和 P
18、D - 1 的表 达: 激发型 C D 3 单抗联合 C D 2 8 单抗刺激T细胞组 中加人单抗 1 F 1 , 培养至第 3 天时, 用 a n t i - C D 9 5 - P E 和a n t i - P D - 1 - P E 标记及F A C S 分析表型显示, T 细胞 上调表达 C D 9 5 和P D - 1 ( 表5 ) 。 表5 单抗 1 F 1 上调 Mc A b C D 3 + 1 0 0 活化的 T细胞 C D 9 5 和P D - 1 的表达( MR, n = 3 ) T a b l e 5 . Mc A b 1 F 1 n p r e g u l a t e
19、d山 e e x p r e s s i o n o f C D 9 5 a n d P D - i o n t h e T c e l l s a c t iv a t e d b y M c A b C D 3 + 1 0 F 3 ( MF I , n二 3 ) M c A b C D 3 +1 0 F 3 + I 酮1 Mc A b C D 3+I O F 3+I F l 3 1 . 0士2. 6 3 7 . 8 土3 A* 1 . 6士0. 2 2. 6t0_ 2* M F I : m e a n fl u o r e s c e n c e in t e n s i t i e s
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- 41 BBL 逆向 信号 人外周血 细胞 体外 活化 调节作用
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