BCRABL酪氨酸蛋白激酶域及其突变体的构建和表达.pdf
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1、书书书 研究原著文章编号: 1000-2790 (2006) 15-1361-04 Bcr-Abl 酪氨酸蛋白激酶域及其突变体的构建和表达 王淑红1, 梁英民2, 邢佩霓3, 刘海妮1, 王耀春4, 杨 曦4, 蒋珊珊2, 李军林4, 李军锋4 (1西安交通大学第一医院肿瘤 内科, 陕西 西安 710061,第四军医大学: 2 唐都医院血液科, 陕西 西安 710038, 4 基础部医学遗传学和发育生物学教研室, 陕西 西安 710033, 3 陕西省人民医院血液科, 陕西 西安 710068 = ) 收稿日期: 2006-01-06; 接受日期: 2006-02-21 基金项目: 国家自然科
2、学基金 (30370598) 通讯作者: 梁英民. Tel:( (029) 84777843 Email: liangym fmmu. edu. cn 作者简介: 王淑红. 硕士生 (导师邢佩霓) . Tel:( (029) 85274334 Email: wsh2003126. com Production, expression and purifica- tion of Bcr-Abl tyrosine kinase domain and its mutants WANG Shu-Hong1,LIANG Ying-Min2,XING Pei-Ni3,LIU Hai- Ni1,WANG Y
3、ao-Chun4,YANG Xi4,JIANG Shan-Shan2,LI Jun- Lin4,LI Jun-Feng4 1Department of Oncology,First Hospital,Xian Jiaotong University, Xian 710061,China, 2Department of Hematology,Tangdu Hos- pital,Fourth Military Medical University,Xian 710038,China, 3Department of Hematology,Peoples Hospital of Shaanxi Pro
4、- vince,Xian 710068,China, 4Department of Medical Genetics & Developmental Biology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University,Xian 710033,China 【Abstract】AIM:To prepare the Bcr-Abl protein tyrosine kinase domain and its mutants,which will lay a foundation for the study on the resi
5、stance to imatinib. METHODS:PCR was used to amplify the sequence of Bcr-Abl protein tyrosine kinase domain from plasmid pGD210.Its main mutants ( T315I, Y253F, E255K,E255V)were got by recombinant PCR and cloned into prokaryotic expression vector pET-32a after sequencing,and the recombinant plasmid w
6、as expressed in E. coli strain BL21 induced by IPTG. The fusion protein was purified from the cell lysates by Ni-NTA affinity chromatography and analyzed by SDS-PAGE. RESULTS:The sequence of Bcr-Abl protein tyrosine kinase domain was successfully cloned,and was identical to that in Gen- Bank. Point-
7、mutants were got by recombinant PCR and then the recombinant plasmid was expressed in BL-21. CONCLUSION: The fragments of Bcr-Abl kinase domain and its mutants can be expressed in inclusion bodies,accounting for over 70% of total bacterial proteins. And the fusion protein can be purified to over 95%
8、 using Ni-NTA affinity chromatography. It will facilitate the research of chronic myeloid leukemia treatment. 【Keywords】 protein-tyrosine kinase;mutation;recombinant, genetic;PCR;fusion expression;protein purifica- tion 【摘 要】目的:制备 Bcr-Abl 激酶域及其突变体-His 的重组 蛋白. 方法: 用 PCR 方法从含有 Bcr-Abl 全长的质粒 pGD210 中扩增
9、出 Bcr-Abl 激酶域片段, 再通过重组 PCR 技术获得激 酶域的几个主要突变体 (T315I, Y253F, E255K, E255V) , 测序 正确后将其克隆到原核表达载体 pET-32a 中, 构建表达激酶 域片段和 His 标签融合表达的载体, IPTG 诱导表达, 得到的融 合蛋白用镍 - 次氮基三乙酸 (Ni-NTA) 琼脂糖进行亲和层析 纯化. 结果: 成功得到了 Bcr-Abl 激酶域及其突变体序列, 经 序列分析证实后将重组质粒转入 BL-21 进行表达. 结论:通 过重组 PCR 技术获得了野生型激酶域及其突变体蛋白. 融合 蛋白表达在包涵体, 占菌体总蛋白的 70
10、%以上. 经 Ni-NTA 镍 珠纯化后, 纯度在 95%以上. 【关键词】蛋白质酪氨酸激酶; 突变; 重组, 遗传; 聚合酶链反 应; 融合表达; 蛋白纯化 【中图号】R392. 11 【文献标识码】A 0 引言 STI571 (格列卫) 是一种特异性 Bcr-Abl 酪氨酸 蛋白激酶抑制剂, 可以竞争性结合 Bcr-Abl 融合蛋白 激酶上的 ATP 结合位点, 是近年慢性粒细胞白血病 (CML) 靶向治疗研究的一项重大进展 1. 临床研究 结果证明对 CML 的疗效显著优于干扰素, 然而像其 他药物一样, 耐药性的产生很快又成为影响 STI571 疗效的一个新的障碍, 而对耐药患者的研究
11、观察中发 现, 引起耐药的主要原因是白血病细胞中 Bcr-Abl 酪 氨酸激酶域重新激活, 并证明了这种重新激活和酪氨 酸激酶域活性中心的基因点突变直接相关 2 -3. 我 们成功克隆并且表达得到了 Bcr-Abl 激酶域及其突 变体蛋白, 为进一步研究 STI571 耐药打下良好的 基础. 1 材料和方法 1. 1 材料 pGD-210 (第四军医大学唐都医院血液 科) ; 原核表达载体 pET-32a, 菌株 XL-10 与 BL-21 由 第四军医大学遗传与发育分子生物学教研室提供; 1631 第四军医大学学报 (J Fourth Mil Med Univ) 2006; 27 (15)
12、http: / / journal. fmmu. edu. cn pMD18 - T (以下简称 T 载体)(TaKaRa 公司) . 引物 由 TaKaRa 公司合成. dNTP, rTaq 聚合酶、 T 载体、 连 接酶、 限制性内切酶、 DNA 酶 (TaKaRa 公司) ; 质粒提 取试剂盒 (上海华舜生物工程有限公司) ; 胰蛋白胨、 酵母粉、 IPTG, DNA 酶、 脱氧胆酸钠 (DOC) 、 溶菌酶、 尿素, 咪唑 (鼎国生物制剂公司进口分装) . 镍 - 次氮 基三乙酸 (Ni-NTA) 琼脂糖 (Qiagen 公司) ; BCA 蛋白 定量试剂盒 (Pierce 公司) .
13、 1. 2 方法 1.2. 1 Bcr-Abl 野生型激酶域片段的扩增、 克隆和鉴 定 以含有 Bcr-Abl 全长的 pGD-210 质粒为模板, 用 PCR 方法扩增激酶域, 引物设计参考文献 3 , 并用 NTIvector8. 0 软件进行比对, 引物为 AK1:5-CG- CAACAAGCCCACTGTCT-3;AK2:5-TCCACT- TCGTCTGAGATACTGGATT-3, PCR 条件为: 95 预 变性 5 min, 94变性 1 min, 56复性 1 min, 72延 伸 1 min, 30 个循环, 72末次循环 7 min, 将 PCR 产 物插入 T 载体,
14、转化 XL-10 大肠杆菌感受态细胞, 提 取质粒并进行酶切鉴定, 所获正确克隆送上海基康公 司测序, 测序正确且正向插入的克隆命名为 Bcr- Abl - TAK. 1. 2. 2 突变体的扩增、 克隆和鉴定 利用重组 PCR 技术获得突变体激酶域. 设计含突变点在内的引物 T315TIUp:5-CAATGATGATATAGAACGGGG-3; T315IDown:5-CATTGAGTTCATGACCTACGG-3,与 扩增野生型激酶域的引物 AK1, AK2 一起分别扩增 突变体的上、 下游片段, 目的片段回收后取等量混合, 95变性 5 min, 72延伸 2 min, 再以延伸产物为模
15、 板, AK1, AK2 为引物进行次级 PCR 扩增, 95 预变 性5 min, 94变性1 min, 58复性1 min, 72延伸1 min, 30 个循环, 72末次循环 7 min. 同样将 PCR 产 物插入 T 载体, 测序正确且正向插入的克隆命名为 T-T315I. 用同样的方法获得其他几个突变体, 引物 分别 为 Y253FUp:5-CGTACACCTCCCCGAACTGG- 3;Y253FDown:5-TCGGGGAGGTGTACGAGGG-3; E255KUp: 5-CGTACACCTTCCCGTACTGG-3; E- 255KDown:5-ACGGGAAGGTGTAC
16、GAGGG-3; E255VUp: 5-CGTACACCACCCCGTACTGG-3; E- 255VDown:5-ACGGGGTGGTGTACGAGGG-3. 分别 命名为 T-Y253F, T-E255K, T-E255V. 1. 2. 3 表达克隆的建立、 鉴定 将克隆 Bcr-Abl- TAK, T-T315I, T-Y253F, T-E255K, T-E255V 分别经限 制性内切酶 EoR酶切、 补平, 再经 Hind酶切, 回 收目的片段. 原核表达载体 pET-32a 经 EoRV, Hind 双酶切后和目的片段相连, 转化, 提取质粒酶切 鉴定. 1. 2. 4 融合蛋白的表
17、达、 鉴定 将酶切鉴定正确的 克隆转化 BL-21 大肠杆菌感受态细胞, 在氨苄青霉素 抗性阳性的 LB 培养基中, 37, 250 r/ min 振荡培养 过夜, 按 1% 转接至 2 mL LB 中, 相同条件振荡培养 约 2. 5 h (A600 nm约为 0. 6) 后加入终浓度 0. 4 mmol/ L 的 IPTG, 诱导培养 3 h, 12 879 g/ min 离心, 收集菌 体, 50 L 去离子水重悬, 加入等量 2 loading buffer 混匀, 100煮沸 10 min, 离心取上清进行 SDS-PAGE 电泳. 将表达的克隆测序正确后分别命名为 AK- 32a,
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- BCRABL 酪氨酸 蛋白激酶 及其 突变体 构建 表达
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