2011细胞生物学技术.ppt
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1、细胞生物学技术,吕冬霞 基础医学院生物学教研室 2011年10月,2011诺贝尔生理学或医学奖!?,2011年10月3日!?,加拿大- 1973 拉尔夫斯坦曼,法国- 1996 朱尔斯霍夫曼,美国- 1998 布鲁斯博伊特勒,诺贝尔生理学或医学奖评审委员会3日认定,本年度3名获奖者“发现免疫系统激活的关键原理,革命性地改变我们大家对免疫系统的理解”,“先天性免疫系统的 活性作用方面的发现”,树状细胞及其在适应性 免疫系统方面作用的发现”,传统意义上,疫苗的作用,在于预防。而以3人所获研究成果为基础,新型疫苗着眼于以新颖手段治疗癌症,获称“治疗性疫苗”,旨在调动人体免疫系统对肿瘤发起“攻击”。另
2、外,他们的成果有助于治疗一些炎症类疾病,如风湿性关节炎。,拉尔夫斯坦曼,诺贝尔生理学或医学奖评审委员会3日确认,2011年度诺贝尔医学奖得主之一、斯坦曼9月30日因胰腺癌去世,终年68岁。,细胞是生物体的结构和功能单位。 一切生命的关键问题都要在细胞里面寻找(1925, Wilson)。,细胞生物学 (cell biology)是从细胞整体、超微和分子水平上研究细胞的结构功能和生命活动规律的科学。,结构功能,细胞的形态结构,普通光学,倒置,荧光,激光扫描共聚焦,电镜,免疫组织化学技术,放射自显影术,流式细胞术,细胞器组分的分析、分离技术,细胞生物学 (cell biology)是从细胞整体、超
3、微和分子水平上研究细胞的结构功能和生命活动规律的科学。,结构功能,第五章 细胞生命现象的研究技术, 细胞生长增殖研究技术 细胞凋亡研究技术 细胞遗传学研究技术 肿瘤细胞学研究技术 药物测试的细胞模型 膜片钳术,第一节 细胞生长增殖研究技术,二、细胞周期分析技术 细胞同步化实验 流式细胞仪检测细胞周期 通过分析CDK的活性检测细胞周期,一、细胞增殖生长力(判定细胞活力) 细胞计数 细胞分裂指数 细胞集落形成实验 3H-TdR渗入法(氚标记胸腺嘧啶核苷) MTT检测细胞生长状况,一、细胞增殖生长力 (一)细胞计数细胞生长曲线的绘制 意义:了解培养细胞增殖详细过程和 细胞生长基本规律,分时间段 连续
4、取材,计数,生长曲线,细胞生长是否稳定 细胞增殖速度变化的进程 增殖高峰出现的时间,细胞生长曲线绘制-实验范例,实验用品 材料 贴壁培养的细胞。 器材 24孔培养板、吸管、胶帽、离心管、 培养皿、半对数坐标纸、盖玻片、细胞计数板、 酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜、普通 光学显微镜、超净工作台、CO2培养箱。 试剂 Hanks液、DMEM培养基 (含10%小牛血清)、0.25%胰蛋白酶消化液、吉姆萨染液。,实验步骤,消化,弃上清离心,制悬液,计数,接种,(21045l04个/ml ) (96孔板,平行3孔),消化,计数,(细胞数/ml),培养时间为横坐标 细胞数为纵坐标,绘制细胞生长曲线,
5、培养细胞,24h 48h 72h 96h-7d/孔,平均值/孔,S,细胞无增殖 少见分裂相,细胞增殖最旺盛 活力最好 实验最佳阶段,细胞增殖饱和 细胞停止增殖 (停滞期),104,105,106,有限、无限细胞系一代生长曲线比较,无接触抑制,接触抑制,1、在进行生长曲线测定时,接种到培养板孔中 的细胞数量应保持每孔一致 (21045l04个/ml) 。 2、接种量应适当,不能过少或过多,过少将使 细胞生长周期延长,过多将导致细胞在实验 未完成前即需传代,这两种情况下所得到的 生长曲线均不能较准确地反应细胞的生长状 况。 不足:活细胞和死细胞同时被计数,误差较大。,注意事项,(二)细胞分裂指数(
6、mitotic index ,MI):,绘制细胞分裂指数曲线 意义:表示细胞增殖旺盛程度,Phases of the Cell cycle,Interphase: G1 S G2 division phase (mitosis phase- M phase ) Nuclear division (Karyokinesis) cytoplasmic division ( Cytokinesis),实验步骤,消化,离心,制悬液,计数,接种,(2104-5l04个/ml 有盖玻片的培养皿中),固定,染色,冲洗,培养细胞,每24h,取盖玻片,(95%乙醇),(吉姆萨),镜检,晾干,盖玻片反扣在载玻片上
7、 (对光观察,细胞面发亮),(选高、中、低3个不同 区域 各1000个细胞),计分裂细胞数,平均值,细胞分裂指数,细胞核紫红色,胞浆蓝、灰蓝、 红或多色性,核仁染深蓝色,观察结构,判定是否为分裂相,P130改错: (1) (2) (3) (4) (5)按21045104/ml的密度将细胞接种于置有盖玻片的培养皿中。 (5)每24h取出1张盖玻片,经95%乙醇固定5min.。 (6)用吉姆萨染液对盖玻片的细胞染色10min。 (7)高倍镜下观察细胞结构,对分裂期细胞及非分裂期细胞加以识别。 (8) 选出细胞密度高、中、低3个不同的区域,每一区域观察1000个细胞,统计并记录其中的分裂细胞数。 (
8、9) 计算上述3个区域的分裂细胞数平均值。 (10)求出分裂细胞在1000个细胞中所占的比例,即可得培养细胞在不同时相点的分裂指数。 (11) 以各时相点为横坐标,各时相点时细胞的分裂指数为纵坐标,绘制培养细胞分裂指数曲线。,细胞分裂指数曲线,细胞分裂指数和细胞数量关系,细胞分裂指数注意事项,掌握好确定分裂相标准,其中主要是确定好划分间期和前期、末期和间期等的界限,当两人以上进行观察时更须如此,并始终一致,否则会发生人为误差。 细胞分裂指数曲线与生长曲线趋势基本一致,但不完全相同,如当细胞增长达饱合密度并进入停止期后,细胞数值很大,而分裂相可完全消失。 操作时动作要轻,以免使盖片上的细胞脱落。
9、,(三)细胞集落形成实验,意义:检验活细胞的增殖能力,避免了在生长曲线绘制时将死细胞或不能分裂细胞计数在内而导致的实验结果误差。,原理:单个细胞在体外持续增殖6代以上,其后代形成一个细胞群体,称为集落或克隆。每个克隆均包含50个细胞以上,大小在0.31.0mm之间。通过计算克隆形成率,来测定测试细胞的增殖能力。,影响集落形成率的因素: 培养液 血清质量、浓度 温度 酸碱度 细胞密度 一般情况下: 初代培养细胞集落形成率低,传代细胞较高; 正常细胞较低,转化细胞较高。,应用: 干细胞研究 肿瘤研究: 肿瘤是由不同增殖及分化能力的瘤细胞群构成,其中仅有部分具有自我更新能力,即肿瘤干细胞。 目前认为
10、,只有肿瘤干细胞具有形成集落的能力。 细胞集落形成实验可以作为抗肿瘤药物或致癌物质检测的有效手段。,以集落抑制率与药物剂量对数作图, 可以得到一条S形曲线,作出药物的IC50(半数抑制率 细胞生长抑制率为50% 时的药物浓度值)。,对于抗癌药物而言,集落抑制率或 集落存活分数是重要的指标,集落抑制率与药物剂量间的关系,细胞集落形成实验范例 (平板克隆形成实验、软琼脂集落形成实验),实验用品:(平板克隆形成实验) 材料:HeLa细胞 试剂:1640培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白 酶、吉姆萨染液。 设备:细胞计数板、60mm培养皿、10ml移 液管、小烧杯、10ml吸管橡皮头、超净 工作台、培
11、养箱、倒置显微镜、离心机、 水浴锅。,实验步骤:,200个/ ml,接种于24孔板, 4个平行孔,每孔加入1 ml (950l细胞悬液50l药液),培养,(23周, 肉眼可见克隆),(甲醇:冰醋酸 3:1),计算,第一节 细胞生长增殖研究技术,二、细胞周期分析技术 细胞同步化实验 流式细胞仪检测细胞周期 通过分析CDK的活性检测细胞周期,一、细胞增殖生长力(判定细胞活力) 细胞计数 细胞分裂指数 细胞集落形成实验 3H-TdR渗入法(氚标记胸腺嘧啶核苷) MTT检测细胞生长状况,(四)3H-TdR渗入法(氚标记胸腺嘧啶核苷),DNA合成速度 意义:反映细胞增殖水平 动态观察细胞复制分裂情况,
12、确定细胞周期各期时间 原理:3H-TdR 能特异掺入DNA 合成(S 期),使新合成的DNA 带核放射性, 掺入量和合成DNA 的速度正相关。,interphase,2N DNA,4N DNA,4N DNA,2N DNA,3H-TdR渗入法,实验用品 材料 贴壁培养的细胞 器材 液闪计数器(液体闪烁计数器 )。 试剂 标记物 5Cimethyl-3H-TdR/ml(5微居里甲基氚标记胸腺嘧啶核苷/毫升),用培养液配成、PBS、0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液。,实验步骤,24h48h,12h24h,加含 培养液,弃原培养液,3H-TdR,清洗,PBS,消化,收集细胞,提取,DN
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