DNA分子标记在实验动物遗传分析中的应用.pdf
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1、2 0 0 8 年l O 月 第1 8 卷第1 0 期 中国比较医学杂志 C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E O c t o b e r 2 0 明 V 0 1 1 8N o 1 0 席t 目情畸e 鸭 g 综述与专论g 谭斗;奢盼、e 分、! ;爷亡石、凹 D N A 分子标记在实验动物遗传分析中的应用 陈丙波,张聪,王根,黄戎娟 ( 第三军医大学实验动物中心,重庆4 0 0 0 3 8 ) 【摘要】D N A 分子标记技术很多基本都是建立在R F L P 、P C R 和重复顺序的基础上的。本文
2、重点介绍了限制 性片段长度多态性( a r l J P ) 标记、随机扩增多态性D N A ( R A P D ) 标记、微卫星D N A ( S 1 R ) 标记、D N A 指纹( D F P ) 标记、扩 增片段长度多态性( A F L P ) 标记等几种重要的D N A 分子标记技术的定义、结构、分布、组成、保守性、优点及丰富的 多态性等。并重点介绍了微卫星D N A ( 铘) 标记在分子遗传监测、遗传多样性分析和遗传血缘关系及个体识别等 领域的应甩。 【关键词】D N A 标记;遗传;实验动物 【中图分类号】R 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 1 7 8 5 6 1 2
3、 0 0 8 ) 1 0 0 0 7 0 - 0 5 A p p l i c a t i o no fD N AM a r k e r sf o rG e n e t i cA n a l y s i si nL a b o r a t o r yA n i m a l s C H E NB i n g b o 。Z H A N GC o n g 。W A N GG e n ,H U A N GR o n g - j u a n ( L a b o r a t o r yA n i m a lC e n t e r ,T h eT h i r dM i l i t a r yM e d i c
4、 a lU n i v e r s i t y ,C h o n g Q i n g4 0 0 0 3 8 ,C h i n a ) I A b s t r a c t 】 M o s tD N Al 瑚t r k e r $ mb a s e do nr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ( R F L P ) ,p o ly m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( P C R ) a n ds e q u e n c er e p e a t T
5、 h i sp a p e ri n t r o d u c e dd e f i n i t i o n ,s t r u c t u r e ,d i s t r i b u t i o n s ,c o m p o s i t i o n ,c o n s e r v a t i o n , a d v a n t a g ea n dp o l y m o r p h i s mo fR F L P ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ) 。r a n d o ma m p
6、 l i f i e dp o l y m o r p h i s mD N A ( R A P D ) ; s h o r tt a n d e mr e p e a t ( S T B ) ,D N Af i n g e r p r i n t i n g ( D F P ) 。a n da m p l i f i e df r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ( A F L P ) 。a n da l s o i n t r o d u c e da p p l i c a t i o n s0 fS T Ri ng e n
7、e t i cd e t e c t i o n ,g e n e t i cp o l y m o r p h i ca n a l y s i s ,b l o o dr e l a t i o n s h i pa n a l y s i s IK e yw o r d s 】D N A ;G e n e t i c ;L a b o r a t o r yA n i m a l s 作为易于识别的基因型表现形式,遗传标记在 动物种质资源的研究和育种工作中有着十分重要的 地位。目前,应用较为广泛的遗传标记有形态标记、 细胞标记、生化标记和分子标记。形态标记指动物 的外部特征,细胞标记主要
8、是染色体的核型和带型, 生化标记主要包括同工酶和贮藏蛋白。这3 种标记 都是基因表达的结果,是对基因的间接反映,标记数 目有限,多态性较差,易受环境条件的影响。而 D N A 分子标记是直接在D N A 分子上检测生物间的 差异。是在D N A 水平上遗传变异的直接反映。D N A 分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官 甚至细胞作检测,数量极多,遍及整个基因组,多态 性高,遗传稳定,不受环境及基因表达与否的限制。 D N A 分子标记从它诞生之日起,就引起了生物学家 极大的兴趣,现已广泛应用于基因标记、遗传连锁分 析、构建遗传图谱、遗传疾病的诊断、法医学鉴定、亲 缘关系和物种的鉴定以及
9、动植物的遗传育种研究 中【卜1 3 。在经历了短短几十年的迅猛发展后,分子 标记技术日趋成熟。现已出现的D N A 分子标记技 术有几十种,基本都是建立在R F L P 、P C R 和重复顺 序的基础上的。下面就几种重要的D N A 分子标记 技术以及微卫星D N A 标记技术在实验动物遗传研 究中的应用加以介绍。 1D N A 分子标记技术 1 1 限制性片段长度多态性( R F L P ) 标记 【通讯作者】陈丙波( 1 9 6 4 - ) ,男。教授硕士导师,研究方向:D N A 分子多态标记。电话:0 2 3 - 6 8 7 5 2 0 5 2 。 万方数据 中国比较医学杂志2 0
10、0 8 年I O 月第1 8 卷第1 0 期C h i nJC o m pM e d ,O c t o b e r2 0 0 8 V 0 1 1 8 N o 1 0 7 1 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m s ,R F L P ) 标记是2 0 世纪8 0 年代初 发展起来的第一代分子标记技术( B o t s t e i n ,e ta 1 , 1 9 8 0 ) 。它利用限制性内切酶可以识别并催化裂解 基因组内某些特异D N A 序列的原理,来检测基因组
11、内特定D N A 片段的差异,这种差异反映了生物基因 水平上的变异。R F L P 标记的数目多呈孟德尔式遗 传,非等位基因的R F L P 之间互不干扰,大多数 R F L P 标记在任何分离群体中都能区分纯合基因型 与杂合基因型。R F L P 技术是一种能够有效检测 D N A 多态性的分子生物技术,R F L P 检测的是基因 组D N A 经限制性内切酶酶切后形成D N A 片段的多 态性。因此在研究群体遗传与系统演化等领域中应 用较多。 R F L P 是第一代分子标记技术,在遗传分析中得 到了广泛应用。训,与传统的遗传标记相比,R F L P 标记具有下列优点:( 1 ) R F
12、 L P 标记无表型效应,其检 测不受外界条件、性别及发育阶段的影响;( 2 ) R F L P 标记等位基因间是共显性的,非等位基因间不存在 上位效应,互不干扰;( 3 ) R F L P 起源于基因组D N A 的自然变异,这些变异在数量上几乎不受限制,可以 选取足够数量能代表整个基因组的R F L P 标记。 R F L P 标记也有其自身的不足,R F L P 与内切酶 的选用密切相关,只能选用一定的内切酶,某个位点 才可能表现出多态性;而且它不能检测出酶切后相 同长度D N A 片段内的碱基变异另外,多态性检出 率低,用放射性标记的探针进行分子杂交,不但程序 复杂繁琐,而且放射性对人
13、体有害- 。 1 2 随机扩增多态性D N A ( R A P D ) 标记 R A P D 技术是1 9 9 0 年发明发展起来的。它以 P C R 技术为背景,以人工合成的碱基顺序随机排列 的寡核苷酸单链为引物,对所研究的基因组D N A 进 行聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ,P C R ) 扩增,产生多态性的R A P D 片段,这些扩增片段的多 态性反映了基因组相应区域的多态性阻“引。R A P D 检测分为个体D N A 和池D N A 两种方法,个体间 R A P D 分析能够反映出个体间和群体内的遗传变异
14、 程度,而池D N A 法则重点突出群体间遗传差异。 R A P D 标记与其它分子标记相比,其优点主要 表现在:第一,R A P D 技术可以在对物种缺乏分子生 物学研究资料的情况下,对其进行D N A 多态性分 析;第二,R A P D 引物可用于不同生物基因组多态性 的研究因此,R A P D 引物可以在规模生产形成商 品,这大大降低了研究费用第三,R A P D 技术以一 系列随机引物对基因组进行检测,因而能检测多个 基因位点,覆盖率比较大,并且引物越多,覆盖面越 广,遗传信息也随之增加,因此R A P D 多态信息含量 ( P I G ) 值波动较大,在0 2 珈9 之间;第四,R
15、A P D 技 术操作快速、简便,不依赖基因组遗传信息,因此在 遗传研究中被广泛使用。 R A P D 标记也有不足的一面。首先是显性遗 传,不能识别杂合子位点,这使得遗传分析相对复 杂;其次,由于随机引物较短,因而对一些P C R 因素 更敏感,重复性较差。一般来说,对于特定的仪器设 备,对其反应条件反复进行优化,可以得到较可靠的 结果1 川。 1 3 微卫星D N A 【S T R ) 标记 S T R 标记( s h o r tt a n d e mr e p e a t ) 又称简单重复序 列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ,S S R
16、) ,是指以少数几个核 苷酸( 1 。6 个,多数为2 。4 个) 为单位多次串联重 复的D N A 序列。这种序列存在于几乎所有真核生 物的基因组中,且呈随机均匀分布。它的本体的拷 贝数在物种间,甚至种内不同个体间存在高度变异 而具有长度多态性。微卫星D N A 作为一种遗传标 记,与其他分子标记相比,具有如下优点:( 1 ) 微卫星 D N A 数量多且均匀分布在大多数真核生物的基因 组中。据估计,真核生物平均每5 0 - - 1 5 0 k b 就存在 一个微卫星位点。它的这一特点为整个基因组中定 位更多的基因提供了极大的方便,这是其他方法所 远远不及的。( 2 ) 微卫星D N A 具
17、有丰富的多态性。 微卫星D N A 标记由核心序列和两侧保守的侧冀序 列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染 色体某一区域,核心序列重复数的差异则形成微卫 星的高度多态性。这种多态性的信息量( P I G ) 是比 较丰富的,一般在0 7 以上。( 3 ) 微卫星D N A 标记 易于检测。一般来说,微卫星D N A 的长度为2 0 0b p 左右,这就很容易进行P C R 扩增,P C R 扩增的高度 灵敏性、高度特异性及操作简便省时使微卫星标记 的检测十分方便,而且准确。( 4 ) 微卫星D N A 标记 具有保守性。微卫星D N A 标记在哺乳动物物种间, 特别是一些紧密相关的物种
18、如牛与羊、马属动物以 及鸡与火鸡间具有一定程度的保守性。( 5 ) 微卫星 D N A 标记呈共显性遗传。微卫星D N A 标记的等位 基因遵循盂德尔遗传规律,能够稳定地从上一代传 给下一代,并且等位基因间呈共显性遗传。因此从 子代可追寻亲代的等位基因,并易于区分纯合型与 万方数据 7 2 中国比较医学杂志2 0 0 8 年l O 月第1 8 卷第1 0 期 C h i nJC o m pM e d 。O c t o b e r2 0 0 8 ,V 0 1 1 8 N o 1 0 杂合型。 当然微卫星D N A 生物技术也有其缺点,即微卫 星标记的获得要建立、筛选基因组文件和克隆、测 序,实验
19、工作量比较大、费时。但是,由于侧翼序列 的保守性,可选用近缘物种的微卫星标记,另一方 面,可通过G e n b a n k 在有关基因序列中寻找微卫星 标记引。 1 4D N A 指纹( D F P ) 标记 D N A 指纹技术( D N Af i n g e r p r i n t i n g ) 是利用微卫 星D N A 作探针,探测不同生物的卫星区,产生相应 的D N A 指纹图谱的杂交方法。在8 0 年代,人类遗 传学家发现,在人体基因组中含有许多分散的具有 串联重复单位的小卫星( m i n i s a t e l l i t e ) ,一般含1 1 6 0 个碱基对,由于重复单位
20、的数字不同和重复拷贝 数的等位性不同,使其表现出高度多态性。J e f f e r y s 等( 1 9 9 1 ) 发现,同一家族的小卫星位点的基本序列 单位,都含有一个1 1 。1 6 个碱基对的相同核心序列 ( c o r es e q u e n c e ) ,由核心序列串联重复构成的人源小 卫星探针,可以同时与众多的基因组的酶切D N A 片 段杂交,得到具有个体特异性的D N A 图谱。不同生 物、同一生物的不同品种,甚至同一品种的不同个 体,其所含小卫星各异,杂交产生的D N A 图谱各不 相同,就象人的指纹一样,所以,把这种具有个体特 征和种属特性的D N A 图谱称之为D N
21、 A 指纹图谱。 D N A 指纹图具有高度的特异性,不同个体或群体有 不同的D N A 指纹图H 。7J 。 D N A 指纹技术的一般过程是:6 5D N A 用限制性 内切酶消化,电泳分离,再转移至膜,用小卫星、微卫 星或合成的寡核昔酸探针以及其他探针予以探测, 形成个体特异性杂交图谱 D N A 指纹具有以下特点:( 1 ) 简单的遗传方式。 D N A 指纹图中的图带可以遗传,这不同于人的指 纹。D N A 指纹图带遵循简单的孟德尔遗传方式。 后代图中的每一条带都可以在双亲之一的图中找 到,除非是因为基因突变而产生个别新带。( 2 ) 体细 胞稳定性。从大量的研究中发现,D N A
22、指纹图带能 够稳定的从上一代传给下一代,子代D N A 指纹图中 的每一条图带均能在双亲的图带中找到,完全符合 孟德尔遗传规律。D N A 指纹图还具有体细胞稳定 性,即从同一个体中不同组织如血液、精液、毛发、肌 肉等产生的D N A 指纹图完全一致。D N A 指纹是分 子水平上进行的检测,其分析结果不受环境和发育 阶段的影响,同一个体的不同组织( 无病变) 、不同年 龄阶段产生的D N A 指纹图完全相同归一引。( 3 ) 多位 点性。由于基因组中存在着上千个小卫星位点,某 些位点的重复单位含有相同或相似的核心序列,在 一定的杂交条件下,一个小卫星探针可以同时与多 个小卫星位点上的等位基因
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- DNA 分子 标记 实验 动物 遗传 分析 中的 应用
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