HPI毒力岛缺失的EAGGEC172突变菌株的构建及其功能研究.pdf
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1、细菌学 HPI 毒力岛缺失的 EAggEC17-2 突变菌株的 构建及其功能研究 胡静俞守义阚飙刘志华 【 摘要 】 目的构建 HPI 毒力岛缺失的 EAggEC17-2 突变株, 初步研究 EAggEC 菌株携带的耶尔 森菌 HPI 毒力岛合成铁载体 Ybt 的功能。方法以 EAggEC17-2 为出发菌株, irp8 基因部分序列作为 同源重组的一侧序列, irp5 基因序列作为同源重组的另一侧序列, 中间插入有氯霉素 (Cm) 抗性基因 (cat 基因) 标记。通过接合转移和同源重组, 构建了缺失约 24 kb 的 HPI 毒力岛功能核心区区域 EA- ggEC17-2 的全岛缺失株 E
2、A85。应用流式细胞技术 (FACS) 检测指示菌株 WA-CS irp1: : KN (pCJG3.3N) 荧光强度的变化情况, 对 EA85 缺失株和出发菌株进行了合成 Ybt 的功能比较研究。结果成功构建 了 EAggEC17-2 HPI 全岛缺失株 EA85。EAggEC17-2 菌株具有表达 Ybt 的功能, 而缺失株 EA85 丧失了 合成 Ybt 的能力。 结论EAggEC17-2 HPI 毒力岛的缺失, 使 Ybt 的合成彻底阻断。EAggEC 17-2 具有的 合成 Ybt 的功能是由其染色体携带的 HPI 毒力岛所决定的。 【 关键词 】 EAggEC;HPI 毒力岛;耶尔
3、森杆菌素;缺失 Analysis of HPI function by constructing EAggEC17-2 mutant deleted HPI full islandHU Jing*,YU Shou-yi,KAN Biao,LIU Zhi-hua. *Department of Epidemiology,Nanfang Medical University,Guangzhou 510515,China Corresponding author:YU Shou-yi,Email:qingchenLfimmu. com 【 Abstract 】 ObjectiveTo analyze
4、 the biosynthesis of siderophore yersiniabactin (Ybt)of high pathoge- nicity island (HPI)in EAggEC strain by constructing EAggEC17-2 mutant deleted HPI full island. Methodsirp8 and irp5 genes by constructed by inserting a selectable substitution with chloramphenicol resistance gene (cat gene) were u
5、sed as two homologous sequences. By homologous recombination and conjunction mobilization,we screened EA85 mutant which deleted about 24 kb HPI core part from irp8 to irp5 gene. Flow cytometry measurement was used to detect Ybt biosynthesis of EA85 mutant and EAggEC17-2 strain by the changing fluore
6、scent signal of a re- porter strain WA-CS irp1: : KN (pCJG3.3N) . ResultsWe constructed EA85 strain successfully,a HPI deleted mutant of EAggEC17-2 strain. EAggEC17-2 strain was able to biosynthesize Ybt while EA85 mutant lost the abili- ty. ConclusionDeletion of EAggEC17-2 HPI resulted in the disab
7、ility of biosynthesizing Ybt. It suggested that Ybt biosynthesis of EAggEC17-2 was depended on the HPI located on its chromosome. 【 Key words 】 EAggEC;High-pathogenicity island (HPI) ;Yersiniabactin;Deletion 基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目资助 (G1999054101) 作者单位: 510515 广州, 南方医科大学流行病学教研室 (胡静, 俞 守义) ; 中国疾病预防控制中心传
8、染病预防控制所 (阚飙) ; 南方医科 大学南方医院感染内科 (刘志华) 通讯 作 者: 俞 守 义, Email: qingchen fimmu. com, 电 话: 020- 61648312 细菌毒力岛的发现和研究对了解细菌致病性 和细菌进化过程具有重要意义。近年来的研究发 现, 一种细菌可以携带有多个不同的毒力岛, 同一毒 力岛也可分布在不同的细菌中。耶尔森菌中的一个 与铁载体 耶尔森杆菌素 (yersiniabactin,Ybt) 合 成转运和调节有关的毒力岛被称为强毒力岛 (high pathogenicity island,HPI) 1。在耶尔森菌中, HPI 仅 存在于鼠疫耶尔
9、森菌 (Yersinia pestis) 、 假结核耶尔森 菌 (Yersinia pseudotuMerculosis) 和小肠结肠炎耶尔森菌 (Yersinia enterocolitica,Yen) 1B 型中, 在铁缺乏条件 表达 Ybt, 并为小鼠毒力表型所必需。其 HPI 有一个 约 30.5 kb 的功能核心区, 它携带有与 Ybt 合成、 调 节和摄取有关的基因簇 yMtA、 irp1 irp9 等基因, 天 门冬氨酸 tRNA (asn-tRNA) 是 HPI 的整合位点 1-3。 自 1998 年 Schubert 等 4首次报道在 93%的集聚黏 附性大肠杆菌 (EAgg
10、EC) 、 27% 的侵袭性大肠杆菌 (EIEC) 、 5%的产毒性大肠杆菌 (ETEC) 和致病性大 肠杆菌 (EPEC) 临床分离株中检出了 HPI 的 irp2/ fyuA 基因簇以来, 陆续有分子流行病学的调查数据 表明 HPI 毒力岛也广泛存在于不同宿主类型的多种 肠道杆菌中 5-8, 如大肠杆菌、 枸橼酸杆菌、 克雷伯菌 和沙门菌等。 196中华微生物学和免疫学杂志 2005 年 8 月第 25 卷第 8 期Chin J Microbiol Immunol,August 2005,Vol 25,No.8 目前, 对肠道杆菌携带的 HPI 毒力岛的研究, 多 为分子流行病学的现况调查
11、, 其结构研究刚刚处于 起步阶段, 其具体的功能及其与宿主致病性的关系 等方面的研究尚未开展。在不同类型致泻性大肠杆 菌中, HPI 毒力岛在 EAggEC 中高频分布的原因, 目 前尚不清楚。鉴于 HPI 在 EAggEC 中的高频分布, 我们拟以 EAggEC 的模式株 (prototype strain) EA- ggEC17-2 为出发菌株, 从构建 HPI 毒力岛全岛缺失 株的角度, 尽可能破坏 HPI 毒力岛的完整结构, 通过 对出发菌株和缺失株合成 Ybt 的功能比较, 初步研 究 HPI 毒力岛在 EAggEC17-2 菌中所发挥的作用。 材料和方法 菌株与质粒: 所用菌株和质
12、粒见表 1。 表 1 实验用菌株与质粒 Table 1. Strains and plasmids in this study Strains and plasmidsDescriptionSource Strains E. coli JM109recA1supE44endA1hsdR17thi(lac-proAB)Our lab F traD36proAB+ lacIqlacZM15 E. coli SM10pirthi-1, thr, leu, tonA, lacY, supE,Our lab recA: : RP4-2-Tc: : Mu,Kmrpir YenWA (0: 8) Proto
13、type of Yesinia enterocoliticaChina CDC WA-CS irp1: : KanrDerivative of WA-CS,NalrSmrKmrProf. Rakin 2 EAggEC 17-2Prototype of enteroaggregative E. coli,HPI+China CDC EA85EAggEC17-2irp8-irp5This study Plasmids pUC18Cloning vector,AmprOur lab pCOS5Cosmid plasmid,CmrOur lab pKNG101Suicide plasmid,mob R
14、P4 Ori R6K,SacB,SmrThis study pH8pMD18-T irp8This study pH5pUC18 irp5This study pH85pUC18 irp5-cat-irp8This study pKH85pKNG101 irp5-cat-irp8This study 在 LB 平板或肉汤中增殖菌株, 小肠结肠炎耶 尔森菌 (Yen) WA 株 (0: 8) 在 28条件下培养, 大肠 杆菌在 37培养。抗生素使用浓度分别为, 氨苄青 霉素 (Ap)100g/ml, 氯霉素 (Cm)20g/ml, 链霉素 (Sm) 50g/ml, 复方甲基异噁唑 (SXT) 1
15、00 g/ml。铁 缺陷培养基 LBD: 1%胰蛋白胨, 0.5%酵母提取物, 0.5%的 NaCl, 加 2-2-双吡啶 (2-2-dipyridyl) 使终浓 度为 200mol/L, 调 pH 为 7.4。 主要试剂: PCR 试剂、 限制性内切酶、 T4 DNA 连 接酶及 dTTP 为大连宝生物工程公司产品; 蔗糖为上 海生工公司产品; 2-2-dipyridyl 为 Sigma 产品; IPTG、 X-gal 为 PROMEGA 公司产品。引物为上海生工公 司合成。 PCR 扩增: 本研究选择了 irp8 和 irp5 基因作为 同源重组的靶序列, 这两个同源序列之间跨越了 HPI
16、 毒力岛约 24 kb 的区域 (图 1) , 包含有 HPI 毒力 岛除 fyuA 之外的 ybtA、 irp2 和 irp6 3 个启动区, 以 及 Ybt 合成转运和调控的某些必需基因, 这个区域 的缺失, 将导致 HPI 毒力岛功能的丧失。 图 1 构建 EAggEC17-2 全岛基因缺失株的缺失区域示 意图 Fig 1. In-frame deletion area of EAggEC 17-2 mutant de- leted HPI full island 根据小肠结肠炎耶尔森菌已知 HPI 基因序列设 计引物, 以 YenWA (0: 8) 染色体 DNA 为模板。引物 序列见
17、表 2。 重组自杀质粒 pKH85 的构建: 质粒提取, 酶切, DNA 片段连接以及转化按常规方法 12或按产品推 荐的条件进行, 构建过程见图 2。 图 2 重组自杀质粒 pKH85 构建示意图 Fig 2. Construction of recombinant suicide plasmid pKH85 质粒 DNA 的接合转移: 参照文献 13 。 EAggEC17-2 全岛基因缺失株的筛选: 将携带有 质粒 pKH85 的 SM17-1pir 菌株与 EAggEC17-2 进行 接合转移, 突变株的遗传特性应符合为: CmrSXTr SacBrSms, 因此, 直接在含有 25g/
18、ml 氯霉素、 150 g/ml SXT、 含 20%蔗糖的培养基上筛选三重抗性重 组株, 将上述平板上长出的菌落平行接种于含有 50 g/ml 链霉素 LBA 平板上, 挑选 Sm s 菌落进行鉴定。 296中华微生物学和免疫学杂志 2005 年 8 月第 25 卷第 8 期Chin J Microbiol Immunol,August 2005,Vol 25,No.8 表 2 本研究工作中所用引物 Table 2. Primers used in this research Fragment amplifiedLength (bp)PrimersReference irp95295-GCT
19、GTCCTGAAATACGGA-33 ,GenBank No: AJ132668 5-AGTGCGCTCGTTTATGTT-3 irp811765-TGTCATCAGTTCTCTTGCCG-33 ,GenBank No: AJ132668 5-CTGGTATCGGCGCTGTCTAT-3 irp615885-TCACCATTGAGAGACGATGC-33 ,GenBank No: AJ132668 5-TTTCCTCTCTGGCAGGTGAT-3 ybtA5555-AGTGCGCTCGTTTATGTT-33 ,GenBank No: AJ132668 5-GCAGCAGTTTCTGACGTT-
20、3 irp22675-AAGGATTCGCCTGTTACCGGAC-39 ,GenBank No: L18881 5-TCGTCGGGCAGCGTTTCTTCT-3 irp17995-CCGGTTATTGTGAAGGTT-32 ,GenBank No: Y12527 5-GTGAATGTTACGGCACTAA-3 irp516365-CGCGGATCCGGTACCAGGTGACGCATGAATTCTTC-32 ,GenBank No: Y12527 5-AACTGCAGTCAACCTGTTTCGGGTCGG-3 fyuA9485-GCTTTATCCTCTGGCCTT-310 ,GenBank
21、No: Z35486 5-GGCATAACGATTAACG-3 cat8015-CGCAGCACCAGGCGTTTAAG-3 5-GATCGGCACGTAAGAGGTTC-3 EAEC6235-CTGGCGAAAGACTGTATCAT-311 5-CAATGTATAGAAATCCGCTGTT-3 流式细胞术 FACS 检测 Ybt 的合成: 在铁缺乏 条件 下(LBD 培 养 基)培 养 报 告 菌 株 WA-CS irp1: : KN (pCJG3.3N)24 48 h, 在 LB 及 LBD 培养 基分别培养待测菌株, 将培养上清按 1:1 的比例分 别加入培养的该报告菌株中, 再加入 2
22、 倍体积新鲜 配制的 LBD 培养基, 继续培养过夜, 取 1 ml 菌液集 菌沉淀, 用 1 ml 生理盐水悬浮, 进行 FACS 检测。流 式细胞仪为 Becton Dickinson 公司产品, 型号为 FAC- SACalibur, 每次测试计数 50 000 个细菌。 结果 1. 重组自杀质粒 pKH85 的构建及鉴定: 将纯 化后的 irp8、 irp5 基因的 PCR 扩增产物分别克隆入 pMD18-T、 pUC18 载体中, 经含 IPTG/X-gal 及氨苄青 霉素的 LB 平板筛选白色菌落, 克隆子分别命名为 pH8 和 pH5。 irp8 基因内有一平端限制性 EcoRV
23、位点 (323 bp) , 用 EcoRV酶切 pH8, 将 cat 基因插入在 irp8 基 因的 EcoRV位点, cat 基因两侧分别有约 843 bp 和 322 bp 左右的 irp8 基因的部分序列, 为了保证同源 重组的有效进行, 必须以 irp8-cat-irp5 的顺序排列, 因此我们选择 irp8 约 843 bp 的一侧序列作为同源 序列。为了得到连有 cat 基因和 843 bp 的 irp8 基因 序列的 DNA 片段, 先通过 PCR 扩增判断 cat 基因在 irp8 基因中的插入方向, 分别用 cat 基因的 2 条引物 与 irp8 的下游引物扩增, 将这个片
24、段命名为 irp8- cat 基因片段 (图 3) 。 图 3 irp8-cat-irp5 排列示意图 Fig 3. The order of irp8-cat-irp5 用 Sma消化 pH5, 纯化回收, 与 PCR 扩增的 irp8-cat 基因片段平端连接, 得克隆子 pH85。因所 需的克隆子必须为 irp8-cat-irp5 的顺序排列, 我们 用 irp5 基因的下游引物和 cat 基因的上游引物进行 PCR 扩增来鉴定插入片段的方向, 符合需要者, 应扩 增出约 2423 bp 的 DNA 片段, 将之命名为 cat-irp5 片段。pH85 克隆子中应插入 1600 左右的
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- HPI 毒力 缺失 EAGGEC172 突变 菌株 构建 及其 功能 研究
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