NA+,K+-ATP酶不参与慢性心衰豚鼠心肌细胞钙瞬变的减小.pdf
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1、中国药理学通报C h i n e s e 懒删B u l l e t i n 2 0 0 9F e b ;2 5 ( 2 ) :2 2 1 4 2 2 1 N a + ,K + - A T P 酶不参与慢性心衰豚鼠心肌细胞钙瞬变的减小 齐亚娟L 2 ,白静2 ,李吉和1 ,李树民1 ,郭会彩1 ,刘雪莉1 ,王永利1 ( 河北医科大学药理学教研室,河北石家庄0 5 0 0 1 7 ;2 华北煤炭医学院药理学教研室,河北唐山0 6 3 0 0 0 ) 中国图书分类号:R - 3 3 2 ;R3 2 2 1 1 ;R3 4 5 6 ;R3 4 8 2 ; R5 4 1 6 1 0 2 2 ;R9
2、7 7 3 ;R9 7 7 6 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1 1 9 7 8 ( 2 0 0 9 ) 0 2 0 2 2 1 0 4 摘要:目的研究N a + ,K + - A T P 酶是否参与慢性心衰 ( c H v ) 豚鼠心肌细胞钙瞬变的减小。方法采用降主动脉 缩窄( C D A ) 法和异丙肾( I S O ) 法建立豚鼠慢性心衰模型;酶 解法急性分离左室心肌细胞;采用无机磷法测定, L , W L 细胞膜 N a + K + A T P 酶活性,采用R T - P C R 和W e s t e r nb l o t 检测 C H F 心肌+ ,K + 一A T P 酶O
3、 t l 、( I t 2 亚单位在m R N A 水平和蛋 白水平的表达。结果C D A 法致心衰后N a + ,K + 一A T P 瑾,、 嘞亚单位在m R N A 水平均明显减少,I S O 法仅I 明显减少, 无变化;但两种方法致豚鼠C H F 后,心肌细胞N a + ,K + 一A T P 酶。亚单位在蛋白水平的表达及酶活性均无改变。结论 豚鼠C H F 后钙瞬变的减小,没有N a + ,K + 一A T P 酶的参与。 关键词:豚鼠;慢性心衰;钙瞬变;N a + ,K + 一A T P 酶 N a + ,K + 一A T P 酶即钠泵广泛存在于人和动物的 各个组织,作为离子泵,它
4、将3 个N a + 移出细胞外, 并将2 个K + 移人细胞内,从而在维持细胞内外N a + 和K + 的稳态中起着关键作用,同时也通过N a + C a 2 + 交换体间接调控着细胞内C a 2 + 的活动。慢 性心衰( C H F ) 后心肌细胞收缩力进行性减退,而 C a 2 + 是介导心肌细胞收缩始动的关键环节,且细胞 内钙瞬变的大小与心肌细胞收缩力的变化相对应。 本室前期研究表明,豚鼠C H F 后心肌细胞钙瞬变减 小2 | 。 收稿日期:2 0 0 8 0 9 0 2 ,修回日期:2 0 0 8 1 l 一2 3 基金项目:河北省自然科学基金资助项目( N o3 0 1 3 6 0
5、 ) 作者简介:齐哑娟( 1 9 7 0 一) ,女,博士,副教授,研究方向:心脑血管 药理学,E - m a i l :y a j u a n q i y a h o o C O I I I c n ; 王永利( 1 9 4 7 一) ,男,博士,教授,博士生导师。研究方向: 心脑血管药理学,通讯作者,E - m a i l :w a n g y l 5 2 h e i n f o n e t 有报道,人心衰后N a + ,K + A T P 酶活性下降, 是造成心律失常电特性改变的原因之一 3 】,但家兔 心衰后,尽管细胞内N a + 升高,N a + ,K + 一A T P 酶的泵 功能
6、并未改变H J 。那么豚鼠心衰后细胞内钙瞬变 减小是否由于C H F 对心肌N a + ,K + A T P 酶的改变 所致呢7 钠泵是由仅、B 、1 亚基组成的寡聚体。其中仅 亚基执行着主要的泵功能口】。已发现豚鼠心肌细 胞只表达仪l 和d 2 亚单位,且0 t 。m R N A 的量远大于 a 2 的量旧oo 本实验采用C D A 和I S O 法建立豚鼠C H F 模 型,检测C H F 心肌N a + ,K + - A T P 酶活性的变化,及 其d ,、仅:亚单位在m R N A 水平和蛋白水平的表达。 以考察N a + ,K + 一A T P 酶是否参与心衰后心肌细胞 内钙的变化。
7、 1 材料与方法 1 1 药品与试剂 N a + ,K + 一A T P 酶试剂盒( 南京 建成生物工程研究所) ,反转录试剂盒( 美国P r o m e g a 公司) ;P C R 试剂盒( 加拿大B BI 公司) ;小 鼠抗大鼠钠泵仅。亚单位及兔抗鼠钠泵O t :亚单位多 克隆抗体( S a n t aC r u z 公司) ;生物素标记的羊抗兔 和羊抗鼠I g G 和辣根酶标记链酶卵白素及D A B 显 色试剂盒( 北京中杉试剂公司) ;B C A 蛋白定量试剂 盒( P i e r c e ) 。其它试剂均为分析纯。 1 2 制备豚鼠C H F 模型C H F 模型制备方法参 考文献
8、心J 。6 豚鼠,体质量2 5 0 3 0 0g ,由河北医 科大学实验动物中心提供。设C D A 和I S O 对照组 各1 0 只,C D A 和I S O 模型组各1 2 只,各组同室饲 养。 1 3 单个心室肌细胞的急性分离参照文献【2 1 采 用L a n g e n d o r f f 灌流法,此法可得到约8 0 呈杆状的 成活心肌细胞。 e x p r e s s i o no fp 2 1g e n ew e r ei n c r e a s e dg r a d u a l l y ,w h i l e C D K 4 ,E 2 F 1a n db a xg e n ew e
9、 r ed e c r e a s e d C o n e l u s i o n C u rm a y b ee f f e c t st h er e d i s t r i b u t i o no fc e l lc y c l e a n da p o p t o s i so fs e r u m d e p r i v e dP C I 2c e l l si n d u c e db y A 1 3 笱- 3 5 ,t h r o u g hi n c r e a s i n gt h em R N Aa n dp r o t e i ne x - p r e s s i o
10、no fp 2 1 ,a n dd e c r e a s i n gt h em R N Aa n dp r o t e i n e x p r e s s i o no fC D K 4 ,E 2 F 1a n db a ng e n e K e yw o r d s :c u r c u m i n ;A B 2 5 - 3 5 ;P C I 2c e l l ;t h ee x p r e s s i o no fg e n e ;p 2 1 ;C D K 4 ;E 2 F 1 ;b a x 万方数据 2 2 2 中国药理学通报C h i n e s eP h a r m a c o
11、l o g i c a lB u l l e t i n2 0 0 9F e b ;2 5 ( 2 ) 1 4 心肌细胞膜N a + ,K + - A T P 酶活性检测采 用无机磷法,按文献“ 1 及A T P 酶试剂盒提供的方法 进行。 1 5R T - P C R 法测定心肌细胞N a + ,K + A T P 酶仅 亚单位m R N A 水平的改变 8 9 1将细胞悬液离心 ( 5 0 0r m i n ,3r a i n ) ,弃去上清,按试剂盒说明提 取总R N A ,逆转录,常规P C R 扩增,2 琼脂糖凝胶 电泳,0 1 E B 溶液显色,紫外灯下观察并照相, B i o l
12、 D 图像分析系统分析目的基因电泳条带的光密 度值,G A P D H 作内标。所有引物均由北京赛百盛基 因公司合成,引物序列见T a b1 。 1 6W e s t e r nb l o t 检测N a + ,K + - A T P 酶蛋白的表 达【引将细胞进行常规W e s t e r nb l o t 检测,1 0 S D S P A G E 电泳分离蛋白,采用P V D F 膜进行半干 转膜,一抗为小鼠抗大鼠钠泵O t 。亚单位及兔抗鼠钠 泵0 【:亚单位多克隆抗体,二抗为生物素标记的羊抗 兔和羊抗鼠I g G ,D A B 试剂盒显色,B i o l D 图像分析 系统分析显色条带的
13、光密度值。G A P D H 作内标。 1 7 统计学方法实验数据以石s 表示,两组数 据间的比较采用S P S S 统计软件进行双侧t 检验。 2 结果 2 1 豚鼠心衰后心肌细胞膜N a + 。K + - A T P 酶活 性的变化结果显示,两对照组N a + ,K + 一A T P 酶活 性分别为( 1 2 2 0 2 0 ) 和( 1 2 6 士0 1 9 ) t L m o l P i m g P r o h ,差异无显著性( P 0 0 5 ) 。C D A 法 和I S O 法所致豚鼠心衰后N a + ,K + 一A T P 酶活性分 别为( 1 0 3 0 2 3 ) 和( 1
14、 3 3 0 3 6 ) I 山m o l P i m g 。1 P r o h ,与对照组比较差异均无显著性( 尸 0 0 5 ) 。 2 2 豚鼠心衰后心肌细胞N a + ,K + - A T P 酶码、她 亚单位在m R N A 水平的变化N a + ,K + 一A T P a s e0 t 与0 t :亚单位的扩增产物均呈单一条带,大小与理论 值( 分别为2 4 7b p 与2 6 4b p ) 吻合( F i g1 A 和F i g 2 A ) 。C D A 法所致豚鼠心衰后N a + ,K + 一A T P 酶碰,、 O t ,亚单位在m R N A 水平的表达量均下降( P 0
15、0 5 ) ,结果见F i g3 ;仅: 亚单位未被检测到,可能因为O t :亚单位在豚鼠心脏 表达量极少之故。 A B F i g1 T h ec h a n g e so ft h eN a + ,K + - A T P a s ea I s u b u n i tm R N Ae x p r e s s i o nb yR T - P C R a n a l y s i si n n o r m a la n dC H I Cg u i n e ap i gl e f tv e n t r i c l e L a n e1 :M a r k e r ;L a n e2a n d4 :C
16、o n1a n dC o n2 ;L a n e3 :C D A :I J a n o 5 :I S O ( C o n1 :s h s , mg r o u p ;C D A :c o n s t r i c t i n gt h ed e s c e n ta o r t ag r o u p : C o n2 :1 5 0c o n t r o lg r o u p ;I S O :i s o p r o t e r e n o l i n j e c t e dg r o u p ) A :A g a r o g e le l e c t r o p h o r e s i sp h
17、o l o 争a p ho ft h ee x p r e s s i o no fN a + ,K + - A T P a s e 口, m R N A B :T h eq u a n t i t i v e a n a l y s i so fN a + ,K + 一A T P a s eO t ,s u b u n i tm R N Ae x p r e s s i o nb yR T P C R P 0 0 1 埘C o n l ,6 P O O l 埘C 帆2 1 O O O O Qu喜ur一号藿羞gDTId廿Al苗la冒 万方数据 中国药理学通报C h i n e s eP h a
18、 r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n2 0 0 9F e b ;2 5 ( 2 ) 2 2 3 A B C o n IC D A C o n 2I S O F i g2T h ec h a n g e so ft h eN a + ,K + - A T P a s e 嘞s u b u n i t m R N Ae x p r e s s i o nb yR T - P C Ra a a t y s l si nn o r m a la n d C H I Cg u i n e ap i gl e f tv e n t r i c l e I A H
19、i e1 :M a r k e r ;L a n e2a n d4 :C o n1a n dC o n2 ;L a n e3 :C D A ;L a l e 5 :I S O ,( C o nl :s h a l l 3g r o u p ;C D A :c o n s t r i c t i n gt h ed e s c e n ta o r t ag r o u p ; C o n2 :I S Oc o n t r o lg r o u p ;I S O :i s o p r o t e r e n o l i n j e c t e dg r o u p ) A :A g a r o
20、s e g e le l e c t r o p h o r e s i sp h o t o g r a p ho ft h ee x p r e s s i o no fN a + ,K + - A T P a s e “2 m R N A B :T h eq u a n t i f i v e a l y s i so fN a + ,K + 一A T P a s ed 2s u b u n i tm R N A e x p r e s s i o nb yR T P C R P O 0 1 C o n l 3 讨论 N a + ,K + A T P 酶通过其离子转运功能,在维持 细胞内
21、外N a + 和K + 的稳态、以及通过N a + C a “交 换间接调控细胞内c a 2 + 的活动中起着重要作用。 豚鼠心衰后心肌细胞钙瞬变减小,因此,有必要考察 心衰后N a + ,K + A T P 酶活性及其表达的变化,从而 检测其是否参与心衰后心肌细胞内钙的变化。 由于N a + ,K + A T P 酶在细胞质内合成后分布 到细胞膜上才能发挥功能,故本实验建立豚鼠C H F 模型后,提取左室心肌细胞膜,然后检测N a + ,K + 一 A T P 酶活性及其在蛋白水平表达的变化。结果表 明,两种方法致豚鼠C H F 后,左室心肌细胞膜N a + , K + - A T P 酶活
22、性及其a 。亚单位在蛋白水平的表达 量均没有明显变化。但尽管多次改变上样量、抗体 浓度、细胞膜量等因素,均不能在蛋白水平检测出 1 4 喜1 2 a 景1 0 工 凸 尝0 8 望 80 6 皇o 4 0 2 Z 0 O B C 0 1 1 1C D AC o n 2I S O F i g3 T h ed t a n g e so ft h eN a + ,K + - A T P s s eqs u b u n i t b yW e s t e r ni m m u n o b l o ta n a l y s i si nn o r m a la n dh e a r t f a i l u
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