SIRNA沉默HIF-1α在缺氧状态下对鼻咽癌细胞VEGF表达的影响.pdf
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1、现代中西医结合杂志M o d e mJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9J u l ,1 8 ( 2 1 ) 2 4 9 9 蘩! 每肇系戮 s i R N A 沉默H I F 一1 仅在缺氧状态下对鼻咽癌细胞 V E G F 表达的影响 曾伟,张建国 ( 广州医学院第二附属医院,广东广州5 1 0 2 6 0 ) 摘要】目的观察体外乏氧培养条件下鼻咽癌细胞系C N E I I 中缺氧诱导因子一1 d ( H I
2、F 一1 a ) 和血管内皮生长因子( V E G F ) 的表达,探讨H I F h 在低氧条件下对鼻咽癌血管 生成的调控作用。方法C o C l 2 化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境,R T P C R 、免疫印迹法 ( W e s t e r nb l o t ) 分别检测缺氧状态下H I F 一1 a 和V E G F 在m R N A 和蛋白水平的表达。采用化 学合成小干扰R N A ( s i R N A ) 介导的R N A 干扰技术( R N A i ) 转染C N E 一细胞。观察转染后 H I F 一1 d 沉默效果。结果低氧条件下,C N E 一细胞H I F l am R N
3、 A 水平稳定,蛋白表达 显著升高,而V E G Fm R N A 和蛋白的表达均显著升高。s i R N A 转染C N E 一后能够显著下 调H I F h 的基因表达,同时V E G F 基因的表达也受到明显抑制。结论缺氧促使C N E 一 细胞H I F 一1 a 在蛋白水平表达升高,并通过转录激活V E G F 的机制调控鼻咽癌血管生成。 关键词】鼻咽癌;乏氧诱导因子一l a ;血管内皮生长因子;小干扰R N A ;R N A 干扰 中图分类号】R 一3 3 2 文献标识码】A【文章编号】1 0 0 8 8 8 4 9 ( 2 0 0 9 ) 2 1 2 4 9 9 0 5 I n
4、f l u e n c eo fs i l e n c i n gH I F 一1 ab ys i R N Ao ne x p r e s s i o no fv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r i nn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m ac e l lu n d e rH y p o x i a Z e n gW e i Z h a n gJ i a n g u o ( T h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t
5、 a lo fG u a n g z h o uM e d i c a lC o l l e g e ,G u a n g z h o u5 1 0 2 6 0 ,G u a n g d o n g ,C h i n a ) A b s t r a c t :O b j e e t i v eI ti st oo b s e r v et h ee x p r e s s i o no fh y p o x i ai n d u c i b l ef a c t o r - 1 a ( H I F 一1 a ) a n dv a s c u l a re n d o t h e l i a l
6、 g r o w t hf a c t o r ( V E G F ) i nh u m a nn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m ac e l l l i n eC N E 一u n d e rh y p o x i ai nv i t r o ,a n da p p r o a c ht h ee f f e e to fH I F l ao nh y p o x i a - a c t i v a t e da n g i o g e n e s i sr e g u l a t i o np a t h w a yi nn a s o
7、p h a r y n g e a lc a r c i n o m a M e t h o d sC o C L 2w a su s e d a sac h e m i c a lh y p o x i a - i n d u c i b l er e a g e n tt Om i m i ct u m o rh y p o x i cm i c r o e n v i r o n m e n t T h ee x p r e s s i o no fH I F l aa n dV E G F o nR N Aa n dp r o t e i nl e v e l sw e r ed e
8、t e c t e db ys e m i q u a n t i t a t i v er e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( R T P C R ) a n dw e s t e l T lb l o t T h eC N E I Ic e l l sw e r et r a n s f e c t e dw i t hR N A i n t e r f e r e n c e ( R N 舢) o r i g i n a t e db ys m a l li
9、 n t e r f e r e n c eR N A ( s i R N A ) T h ec h a n g eo fV E G Fg e n ee x p r e s s i o nw a so b s e r v e da f t e rH I F l ag e n es i l e n c e R e s u l t sU n d e rh y p o x i a 。t h em R N Al e v e l so fH I F l aw a ss t a b l e w h i l ei t sp r o t e i nl e v e lW a si n c r e a s e d
10、o b v i o u s l y ;b o t hm R N Aa n dp r o t e i nl e v e l so fV E G F w e r eu p - r e g u l a t e d A f t e rs i R N At a r g e t i n g ,t h eH I F l ag e n ew a sd o w n r e g u l a t e de f f i c i e n t l yi nC N E I Ic e l l s ,a n dV E G F g e n ew a sd o w n r e g u l a t e d 嬲w e l l C o
11、n c l u s i o nH y p o x i ac a ni n c r e a s ep r o t e i nl e v e lo fH I F l ai nC N E 一H I F l ac a nu p - r e g u l a t e st h eg e n ee x p r e s s i o no fV E G Fw h i c hp r o m o t e sa n g l o g e n e s i si nh u m a nn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a K e yw o r d s :n a s o p
12、h a r y n g e a Ic a r c i n o m a ;h y p o x i a i n d u c i b l ef a c t O r 一1a l p h a :v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ;s m a l li n t e r f e r e n c eR N A ;R N Ai n t e r f e r e n c e 恶性肿瘤快速生长和肿瘤内部血液供应相对不足常常导 致肿瘤内部形成缺氧微环境,因此,肿瘤细胞对缺氧的适应和 血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤,且与肿瘤的生长和
13、扩散密切相关【1 。在此过程中缺氧诱导因子一l a ( H I F l a ) 【作者简介】曾伟( 1 9 8 l 一) 。男。硬士,研究方向为头颈部肿瘤的 诊治。 通信作者】张建国,就职于广州医学院第二附属医院耳鼻喉 科E m a i l :i n t z j g y a h 0 0 t o m c I l 起到中枢纽带作用;H I F h 是调节肿瘤细胞缺氧反应的主 要转录因子,其在许多肿瘤中高表达,其与肿瘤高度侵袭性、 易转移、对放化疗不敏感和预后不良密切相关。血管内皮生 长因子( V E G F ) 是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,对血 管形成具有重要作用;同时,V E G F 的活
14、性亦受到多种因素的 调控;近年研究发现,V E G F 在缺氧组织中的转录活化主要受 H I F l a 调节,并保持其m R N A 的稳定性。因此,以H I F a 和V E G F 为靶点的基因治疗将为有效抑制肿瘤的生长提供 新途径。本研究以鼻咽癌细胞系C N E 一为研究对象,通过 万方数据 现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n MC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9J u l ,1 8 ( 2 1 ) 体外模
15、拟缺氧微环境,以R N A 干扰为基础,采用脂质体介导 的转染方法,研究H I F l a 小干扰R N A ( s i R N A ) 对缺氧诱导 的C N E 一细胞转染前后低氧条件下H I F l q 和V E G F 的 表达,初步探讨H I F 一1 a 在缺氧条件下对鼻咽癌血管生成的 调控作用。 1 实验资料 1 1 材料和仪器鼻咽癌细胞C N E 一购自中山大学细胞 库;1 6 4 0 细胞培养基购自H y c l o n e 公司,标准胎牛血清和含 E D T A 的胰蛋白酶均购自天津T B D 公司;氯化钴( C 0 c l ,) 购 于广州威佳科技公司;T R I Z O
16、L 试剂、逆转录试剂盒和P C R 试剂盒均购于T i a n g e n 公司。P C R 引物由上海博尚公司合成; s i R N A 干扰片段序列由广州锐博公司设计及合成;脂质体 L i p o f e c t a m i n e T M2 0 0 0 购自I n v i t r o g e n 公司;兔抗H I F 一1 a 多 克隆抗体购自S a n t aC r u z 公司,兔抗V E G F 多克隆抗体购于 N e o m a r k e r s 公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔I g O 二抗购 于博士德公司;P V D F 膜购自P A L L 公司,E C L 显色试剂盒
17、购 于T i a n g e n 公司。c c h 培养箱为美国S H E L L A B 公司产品,生 物安全柜购自T h e r m o 公司,相差倒置荧光显微镜为C a r l Z e i z z 公司产品,G e n e A m p9 7 0 0 型P C R 仪为美国A B I 公司产 品,蛋白电泳及转膜系统为B i o R a d 公司产品。 1 2 方法 1 2 1 细胞培养鼻咽癌细胞C N E 一用含1 0 胎牛血 清,1 0 0I U m L 青霉素,1 0 0u g L 链霉素的R P M I l 6 4 0 培养 液,在3 7 、5 0 3 2 培养箱中培养,细胞贴壁生长
18、,每周传 代培养2 次,以保持细胞在对数生长期。低氧环境通过在培 养基中加入C o C I :实现。本研究采用化学缺氧诱导剂C O C l 2 加入培养基的终浓度为1 0 0 t m o l L 来模拟肿瘤内部缺氧微 环境。 1 2 2s i R N A 的合成根据G e n B a n k 中H I F h 基因( N M 一 0 0 1 5 3 0 ) 的m R N A 序列设计s i R N A 作用靶点,其靶序列为 T A C G l v r G T G A G T G G T A T T A T T ( 1 3 0 2 1 3 2 2 ) ;并设计合 成无义对照序列:A A T T
19、C T C c G 从C G T G T C A C G T ( 广州锐博 生物公司) ;s i R N A 和无义对照序列都在G e n B a n kd a t a b a s e 进 行B L A S T 检索,所设计的s i R N A 序列仅与人H I F l a 序列 相配,而无义寡核苷酸对照链顺序不与任何人基因序列相配。 1 2 3 缺氧干预及R N A 干扰取对数期的细胞以( 2 5 ) 1 0 5 孔。1 接种至含2m LR P M l l 6 4 0 培养液的6 孔板中,置于 5 c c h 、3 71 2 空气培养箱中培养,待细胞培养至9 0 融合度 时按要求分为常氧组、
20、单纯缺氧组、反义寡核苷酸缺氧组 ( s i R N 蝻F l 。) 和无义寡核苷酸缺氧组( s i R N A H l F l 。) ;弃除培 养液,常氧组、单纯缺氧组:每孔加入2m L 含1 0 胎牛血清 的R P M l l 6 4 0 培养液;s i R N A 占I F l 。及s i R N A H I F l 。缺氧组:根 据细胞转染试剂L i p o f e c t a m i n e T M2 0 0 0 的转染操作说明每孔 分别加入5 0 0 “L 含反义寡核苷酸无义寡核苷酸的转染复合 物及15 0 0 肛L 无血清R P M l l 6 4 0 培养液;各组均置于5 c 0
21、 2 、3 7 1 2 空气培养箱中培养;培养6h 后,s i R N A 二l F - l 。及s i R N A 面F 一1 。缺氧组更换含1 0 胎牛血清的R P M l l 6 4 02m L ;转 染2 4h 后,单纯缺氧组、s i R N A 矗I F 一1 。及s i R N A f i I F - 1 。缺氧组更 换含化学缺氧诱导剂C O C l 2 的R P M I l 6 4 0 培养基2m L ;继续 置于5 c 0 2 、3 71 2 空气培养箱中培养,2 4h 及4 8h 后分别行 R T P C R 检测及W e s t e r nb l o t 检测。 1 2 4
22、 半定量R T P C R 检测m R N A 的表达T R I Z O L 法 提取各组细胞的总R N A 并定量;各样本取1 弘g 总R N A 。按 T i a n g e n 公司试剂盒说明进行逆转录;取e D N A 5 止样本,常 规P C R 反应,p a c t i n 为内对照。P C R 引物如下:p a c t i n 上游为5 一T C C A T C A T G A A G T G T G A C G T 一3 。下游5 一 T A C T C C T G C T T G C T G A T C C A C 一3 ( 2 4 5 b p ) ;H I F l a 上游
23、 5 一C A A A A C A C A C A G C G A A G C 一3 ,下游5 一T C A A C C C A G A C A T A T C C A C C 一3 ( 4 7 3 b p ) ;V E G F 上游5 一C C A T G A A C T T T C T G C T G T C 门1 G G 一3 。下游5 一C T C A C C G C C T C G G ( T G T C A C 一3 ( 7 0 2 b p ) 。反应条件为:H I F l a :预 变性9 4 2m i n ;9 5 4 5s ,6 41 2lm i n ,7 2 1r a i
24、n ,共2 7 个 循环;7 2 延伸1 5m i n ;V E G F :预变性9 4 2m i n ;9 51 24 5 s ,6 3 3 0s ,7 2 1m i n ,共2 8 个循环;7 2 延伸1 5r a i n 。 2 琼脂糖凝胶电泳检测P C R 产物。B a n d l e a d e r 3 0 软件对成 像结果进行灰度扫描分析,每组检测5 个样本。应用8 一a c t i n 的光密度值作为内对照,得出H I F l am R N A 和V E G Fm R N A 表达的相对比值。R T P C R 产物比值= ( H I F l a ( V E G F ) m R
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