T2毒素对软骨细胞合成一氧化氮的影响.pdf
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1、第2 7 卷第2 期 2 0 0 6 年 4 月 西 安 交 通 大 学 学 报 (医 学 版 ) J o u r n a l o f X i a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y ( Me d i c a l S c i e n c e s ) Vo l . 2 7 No . 2 Ap r . 2 0 0 6 T - 2 毒素对软骨细胞合成一氧化氮的影响 杨占田 , 陈静宏 , 楚雍烈“ , 曹峻岭 , 王治伦 , 师钟丽 , 郭雄 ( 西安交通大学医学院: 1 . 环境与疾病相关基因教育部重点实验室; 2 .病原微生物教研室, 陕西西安7 1 0
2、0 6 1 ) 摘要: a的探讨 T - 2 毒素对软骨细胞合成一氧化氮( N O ) 的影响。方法胎儿软骨细胞体外培养, 用 MT T法检测 软骨细胞存活率; 用 G r i e s s 重氮化法测定软骨细胞培养上清液中N O含量; 用We s t e r n b l o t 检测软骨细胞一氧化氮合 酶O N O S ) 的表达。t o 果 T - 2 毒素在质量浓度在1 -2 0 0 0 p g / 1 . 的范围内, 软骨细胞存活率对其呈较典型的浓度依 赖关系和时间依赖关系, 而且随着作用时间的延长, 浓度依赖关系更为明显; T - 2 毒素刺激软骨细胞分泌 N O和表达 i N O S
3、 蛋白。t o 8 4 T - 2 毒素引起的软骨细胞损伤和生长抑制与T - 2 毒素刺激软骨细胞表达 i N O S 蛋白和分泌 N O增 多有关。 关键词: T - 2 毒素; 软骨细胞; 一氧化氮; 一氧化氮合酶 中图分类号: R 3 9 4 . 2文献标识码: A文章编号: 1 6 7 1 - 8 2 5 9 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 1 5 0 - 0 3 E f f e c t s o f T - 2 t o x i n o n n i t r i c o x i d e p r o d u c t i o n i n c h o n d r o c y t e s
4、Y a n g Z h a n t i a n , C h e n J i n g h o n g , C h u Y o n g l i e 2 , C a o J u n l i n g , Wa n g Z h i l u n , S h i Z h o n g l i , G u o X i o n g ( 1 . K e y L a b o r a t o r y o f E n v i r o n me n t a n d G e n e s R e l a t e d t o D i s e a s e s o f Mi n i s t r y o f E d u c a t i
5、 o n ; 2 . D e p a r t me n t o f Mi c r o b i o l o g y , Me d i c a l S c h o o l o f X i a n J i a o t o n g Un i v e r s i t y , X i a n 7 1 0 0 6 1 , C h i n a ) A B S T R A C T : O b j e c t iv e T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f T - 2 t o x i n o n n i t r i c o x i d e ( N O
6、) p r o d u c t i o n a n d n i t r i c o x i d e s y n t h a s e O N O S ) e x p r e s s i o n i n c h o n d r o c y t e s . M e t h o d s H u m a n c h o n d r o c y t e s c u l t u r e d i n v i t r o w e r e t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f T - 2 t o x i n
7、i n d i f f e r e n t t i m e ( 1 一5 d a y ) . C e l l v i a b i l i t y o f t h e t r e a t e d c e l l s w a s m e a s u r e d b y MT T a s s a y ; T h e l e v e l s o f N O i n c u l t u r e me d i a w e r e d e t e c t e d b y c o l o r i me t r i c m e t h o d o f G r i e s s a s s a y ; i N O
8、S p r o t e i n w a s m e a s u r e d b y We s t e r n b l o t . R e s u l t s D o s e - d e p e n d e n t a n d t i m e d e p e n d e n t e f f e c t s o f T - 2 t o x i n w e r e f o u n d o n T - 2 t o x i n t r e a t e d c h o n d r o c y t e s w i t h i n a c e r t a i n r a n g e o f c o n c e
9、 n t r a t i o n ( 1 一2 0 0 0 ,u g / L ) a n d a p e r i o d s o f t i m e ( 1 一5 d a y ) ; T h e l e v e l s o f N O i n T - 2 t o x i n t r e a t e d c u l t u r e m e d i a w e r e h i g h e r t h a n t h a t o f n o r m a l c o n t r o l g r o u p ; O v e r - e x p r e s s i o n o f i N O S w a
10、s d e t e c t e d i n T - 2 t o x i n t r e a t e d c e l l s . C o n c lu s i o n T - 2 t o x i n c a n e n h a n c e N O p r o d u c t i o n a n d u p - r e g u l a t e e x p r e s s i o n o f i N O S . N O p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n T - 2 t o x i n i n d u c e d g r o w t h i n h
11、 i b i t o r y a n d t o x i c e f f e c t s . K E Y WO R D S : T - 2 t o x i n ; c h o n d r o c y t e s ; n i t r i c o x i d e ; n i t r i c o x id e s y n t h a s e T - 2 毒素的病因学意义是目前大骨节病研究领 域的热点。大量研究发现 T - 2 毒素可致软骨细胞损 伤 r 。本研究采用胎儿软骨细胞体外培养, 观察 T - 2 毒素对软骨细胞分泌一氧化氮( n i t r i c o x i d e , N O ) 及
12、其诱导型一氧化氮合酶( n i t r i c o x i d e s y n t h a s e , i N O S ) 的影响, 旨在探讨 T - 2 毒素致软骨细胞损伤的 分子机理。 1 材料与方法 1 . 1 试剂与仪器D ME M培养基( G I B C O) , 胰蛋 收稿日期: 2 0 0 5 - 0 7 - 0 4修回日期: 2 0 0 5 - 1 0 - 2 0 墓金项目: 教育部科技重点项目( 重点0 3 1 5 2 ) . 通讯作者: 陈静宏. E - m a i l ; j i x i a n g 4 6 )1 6 3 . c o m 作者简介: 杨占田( 1 9 6
13、1 - ) , 男( 汉族) , 主管技师. 白酶、 透明质酸酶和1 1 型胶原酶( S i g m a ) , i N O S 单克 隆抗体 ( 博 士德生物工程公 司) 、 四甲基偶氮哇 ( MT T ) 、 二甲基亚矾( D MS O ) , N - 1 蔡乙二胺盐酸盐 和磺胺( 华美生物工程公司) , T - 2毒素由中国军事 医学科学院毒物药物研究所杨进生教授赠送, 7 5 2 型 紫外分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) , E l x 8 0 0 型通用酶标仪( 基因公司) 。 1 . 2 软骨细胞培养及分组中孕引产胎儿的软骨细 胞原代培养方法同文献 2 。第一代软骨细胞培养
14、 4 8 h 后随机分为对照组、 T - 2 毒素处理组, 将不同质 量浓度 T - 2毒素( 1 , 5 , 1 0 , 2 0 , 5 0 , 1 0 0 , 1 0 0 0 , 2 0 0 0 , 4 0 0 0 , 8 0 0 0 t .g / L ) 溶于D M E M完全培养基中( 含 1 5 0 m L / L F C S , 青霉素 1 0 0 U / M L , 链霉素 1 0 0 U / M L ) o 2 期杨占田, 陈静宏, 楚雍烈, 等. T - 2 毒素对软骨细胞合成一氧化氮的影响 门nn 09八凡 月二 根据 T - 2毒素对软骨细胞的作用, 再选择 1 , 1
15、0 , 2 0 ji g / L T - 2 毒素处理组作进一步的检测。 1 . 3 观察指标 1 . 3 . 1 MT T法检测细胞存活率第一代软骨细胞 悬液2 0 0 p L ( 含5 X 1 0 3 的软骨细胞) 接种于9 6 孔组 织培养板, 贴壁生长4 8 h 后, 加人含不同浓度 T - 2 毒 素的培养液, 每组设 6 个平行孔, 分别培养 1 -5 d , 然 后加人2 0 Ii L M T T ( 5 g / L ) , 继续培养4 h 后, 弃去培 养液, 加人二甲 基亚矾1 5 0 tA L , 用力振荡5 m i n 使甲 腊结晶溶解完全, 最后置于酶标仪 4 9 0
16、n m处测定A 值。细胞存活率用下列公式计算: 7 0 60 00 、魂咔 3 0 2 0 岁云1q.1钾月一nll。口 s 1 0 2 0 5 0】 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 8 0 0 0 C o n c e n t r a t i o n o f T - 2 t o x i n ( t i g / L ) 细 胞 存 活 率 一 爵 肇 墨 丢 义 1 0 0 0 o 1 . 3 . 2 N O浓度测定鉴于 N O的性质极不稳定, 在体内、 体外均能很快生成亚硝酸盐和硝酸盐, 因此 测定样品中的亚硝酸盐和硝酸盐可作为衡量 N O合 成的指标。本实验采用 G
17、r i e s s 重氮化法。取细胞培 养上清0 . 5 m l , , 加人0 . 5 m L G r i e s s 试剂( 1 0 g / L 磺 胺和1 g / L蔡乙二胺盐酸盐等量混合) , 混匀室温放 置 1 0 mi n , 于紫外分光光度计 5 4 0 n m处测定 A值, 以亚硝酸钠为标准, 计算 N O浓度。 1 . 3 . 3 I N O S的检侧采用 We s t e r n b l o t i n g 分析。 各组 T - 2 毒素作用于软骨细胞 5 d , 收集各组软骨细 胞, 常规提取蛋白质, 进行 S D S - P A G E后, 电转移至 硝酸纤维 ( N
18、C ) 膜上, 按文献 3 进行免疫印迹 ( We s t e r n b l o t t i n g ) 检测, 凝胶成像系统测定积分吸 光度值。 1 . 4 统计分析结果以均数士标准差( x 士: ) 表示, 采用S P S S 1 0 . 0 软件包统计分析, 各组间比较采用方 差分析, P O . 0 5 为差异有显著性。 图1 不同浓度T - 2 毒素在不同作用时间对软骨细胞存活 率的影响 F i g . 1 E f f e c t s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n T - 2 t o x i n o n t h e
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- T2 毒素 软骨 细胞 合成 一氧化氮 影响
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