[商检标准]-SNT 1087-2002 牛Q热微量补体结合试验操作规程.pdf
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1、牛Q热微量补体结合试验操作规程 Procedure of micro complement fixation test for bovine Q fever SN/T 1087 2002 前 言 本标准按照GB/T 1.1 1993标准化工作导则第1单元:标准的起草与表述规则第1部分:标准编写的基本规定的要求,对原中华人民共和国 进出境动物检疫规程手册(1997年12月)中的“ 牛Q热微量补体结合试验” 进行修订。 本标准的附录A是标准的附录。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局、广州出入境检验检疫局。 本标准主要起
2、草人:柯忠哲、朱世强、林志雄、张立怀、范华炜。 本标准系首次发表的检验检疫行业标准。 1范围 本标准规定了牛Q热微量补体结合试验的操作技术要求。 本标准适用于牛、羊Q热微量补体结合试验抗体的检测,其他哺乳动物可以参照本标准。 2引用标准 下列标准所包含的条文,通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时,所示版本均为有效。所有标准都被修订,使用本标准的各 方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB/T 6682 1992分析实验室用水规格和试验方法 3器材及试剂 3.1器材 3.1.1 微量板:U型底96孔板。 3.1.2 加样器:8道5 L50 L可调式移液器,10 L750 L可
3、调式移液器。 3.1.3 各种规格塑料滴头、刻度玻璃吸管、试管、试管架。 3.1.4 离心机:低速,使用水平转子。 3.1.5 水浴锅:可调节温度。 3.2 试剂 3.2.1 抗原:按说明保存和使用。 3.2.2 标准抗原:按说明保存和使用。 3.2.3 标准阳性血清:按说明保存和使用。 3.2.4 标准阴性血清:按说明保存和使用。 3.2.5 被检血清:从被检动物静脉采血,分离血清,4保存。 3.2.6 补体:按说明保存和使用。 3.2.7 溶血素:按说明保存和使用。 3.2.8 试验用蒸馏水为GB/T 6682中的三级水。 4预备试验 4.1 2%绵羊红细胞悬液:采成年绵羊血,一份血加1.
4、2倍量的阿氏液,混匀,4保存,5 d后备用。使用前摇匀,取出10 mL,用离心机以2 000 r/min离心5 min,弃去上清液,将下沉的红细胞泥用20倍量巴比妥缓冲液(VBD)洗涤,以2 000 r/min离心5 min,重复洗涤三次,最后一次离心10 min。取下沉的红细胞泥用VBD配制成2%(V/V)悬液。 4.2 溶血素效价的测定 4.2.1溶血素的稀释:取溶血素0.1 mL加VBD 9.9 mL混匀(如果是等量甘油保存的溶液,取溶血素0.2 mL加VBD 9.8 mL),制成100倍稀释的溶血素,再 按表1稀释成不同倍数。 表1 溶血素的稀释表 4.2.2补体的稀释:按表2对补体做
5、不同倍数的稀释。 表2 补体的稀释表 4.2.3 致敏红细胞悬液的制备:将不同稀释度(150016 000)的溶血素与等量的2%红细胞悬液混合,置37水浴15 min,为致敏红细胞。 4.2.4 溶血素效价的滴定:采用方阵法在微量板上滴定。如表3所示,19列为溶血素稀释度(150016 000),AH行为补体稀释度(1301 100)。吸取不同稀释度的致敏红细胞悬液50 L,分别滴加于19列的各孔中。吸取不同稀释度的补体50 L,分别滴于AH行各孔中,每孔再加25 L VBD,滴加完毕后,置微量振荡器上混匀,随后置37温箱中感作30min后进行初判,置室温2 h、水平转子离心机2 000 r/
6、min离心5 min或置4冰 箱中过夜后进行终判。 4.2.5 溶血素效价的判读:对比标准溶血孔(见附录A)进行,在最小量的补体存在下,能使90%红细胞发生溶血的最高稀释倍数为一个单位溶血素,测 定补体效价和做本试验时用两个单位溶血素。如表3的测定结果为,补体在170稀释时,发生90%溶血的最少溶血素为14 000,该14 000为一个 单位溶血素。两个单位溶血素为12 000。 表3 溶血素效价滴定判定举例表 注:+为50%溶血;+为75%溶血;-为100%溶血 4.3 补体效价的测定: 4.3.1 按照表2配制1301100的补体; 4.3.2 使用两个单位溶血素,制备致敏红细胞悬液; 4
7、.3.3 按照表4在微量板上滴定补体效价。18列为1301100稀释的补体,各稀释度按表中定量添加,再以VBD补充至每孔50 L;每孔滴加25 L的抗原后,再滴加50 L 2%致敏红细胞悬液,充分振荡混匀后,置37温箱中感作30 min后进行初判,然后置室温2 h、水平转子离心机2 000 r/min离心5 min或置4冰箱中过夜后进行终判。4.3.4补体效价的判读:对比标准溶血孔(见附录A)进行,取30 L补体呈现90%溶血,20 L补体呈现 75%90%溶血时补体的最高稀释度作为补体的效价。在正式试验时补体用量为25 L,如表5的测定结果,170的补体25 L为一个单位补体,试验时 123
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