冷冻猪肝细胞在生物型人工肝系统中的生存状态研究.pdf
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1、文章编号: 1000-5404 (2005) 12-1247-03论著 冷冻猪肝细胞在生物型人工肝系统中的生存状态研究 周霖1, 薛毅珑2, 楼敏1, 田磊2, 李雁凌2, 张佐云2, 杨永平1( 1 解放军 302 医院感染内科, 北京 100039;2解放军 总医院老年医学研究所细胞生物学研究室, 北京 100853) 提要:目的研究冷冻复温后猪肝细胞在生物型人工肝支持系统 (BALSS) 中的生存状态。方法用酶法从中国实 验用小型猪肝脏分离出猪肝细胞; 将 1 1010猪肝细胞冷冻保存在 - 196 液氮中; 1 个月后复温, 将等量的冷冻和新鲜猪 肝细胞分别培养在 BALSS 中, 比
2、较其形态、 存活率和白蛋白、 尿素、 葡萄糖合成功能及对利多卡因的转化功能。结果冷 冻保存的猪肝细胞, 复温后其存活率较高; 在培养于 BALSS 时其生化功能、 利多卡因转化功能及超微结构与新鲜肝细胞类 似。结论用该冻存方法保存的猪肝细胞可试用于 BALSS 系统。 关键词:猪肝细胞; 低温保存; 生物型人工肝 中图法分类号:R318.14;R322.47;R329.28文献标识码:A Living states of cryopreserved porcine hepatocytes in biological artificial liver support system ZHOU Li
3、n1,XUE Yi-long2,LOU Min1,TIAN Lei2,LI Yan-ling2,ZHANG Zuo-yun2, YANG Yong-ping1(1Department of Infec- tious Diseases,No. 302 Hospital of PLA, Beijing 100039; 2Department of Cell Biology,Institute of Geraeology,The General Hospital of PLA,Bei- jing 100853,China) Abstract:ObjectiveTo study the living
4、states of cryopreserved porcine hepatocytes under the support of bio- logical artificial liver system. MethodsPorcine hepatocytes were isolated from Chinese experimental miniature swines by collagenase digestion and stored with aliquots of 1 1 010 cells at - 196 liquid nitrogen. After 1 month,the st
5、ored cells were resuscitated and cultured in bioartificial liver support system(BALSS) . Fresh hepato- cytes at same amount were served as control. The morphology,survival rate,and functions of synthesizing albumin, urea and glucose and transforming lidocaine were observed. ResuItsThe survival rate
6、of the frozen hepatocytes was high. There was no obvious difference of the two group in the cell function and microstructure. ConcIusionThe re- sults indicate that cryopreserved hepatocytes can be used in BALSS. Key words:porcine hepatocytes;cryopreservation;bioartificial liver 近10 年来, 生物型人工肝支持系统 (b
7、ioartificial liver support system, BALSS) 的研究方兴未艾 13 。国内外动 物及临床实验 47 表明它是治疗暴发型肝衰竭 (fulmi- nant hepatic failure,FHF) 及肝移植桥接的有效方法。储 备大规模的肝细胞以备 BALSS 治疗之需, 是 BALSS 技 术广泛应用的基础。我们通过对降温过程、 冷冻保护 液、 细胞密度和复温后洗脱条件的探索, 建立了自己的 大规模猪肝细胞的低温保存方法 8 。但尚不明确冷冻 复温后猪肝细胞是否能够在生物反应器中大规模培养。 作者简介: 周霖 (1974 - ) , 男, 湖北省黄冈县人, 硕
8、士, 主治医师, 主要从事 生物型人工肝及肝细胞移植的基础与临床方面的研究。电话: (010) 6693342 收稿日期: 2004-04-08; 修回日期: 2004-10-15 本研究对培养于 TECA-型 BALSS 的新鲜猪肝细胞和 冷冻复温后猪肝细胞的功能、 形态及活率进行比较, 以 探讨冷冻猪肝细胞在 BALSS 中的生存状态。 1材料与方法 1.1材料 中国实验用小型猪 10 只, 体质量 6 8 kg, 雌雄不限, 由解 放军总医院实验动物中心提供; 冻存袋由美国 Baxter 公司提 供; WKL-97 型程控降温仪购自军事医学科学院仪器厂; Nuaire - 85 低温冰箱
9、; HW1 型电热恒温水浴箱; TECA-I 型 BALSS 系 统、 混合胶原酶、 营养液粉剂由香港德矩国际有限公司提供; DMSO 为北京石鹰化工厂产品; 牛血清白蛋白购自华美公司。 1.2方法 1.2.1肝细胞分离采用改良的胶原酶灌注法分离猪肝细 7421 第 27 卷第 12 期 2005 年 6 月 第三军医大学学报 ACTAACADEMIAEMEDICINAEMILITARISTERTIAE Vol. 27,No. 12 Jun. 2005 胞 (见另文阐述) 。 1.2.2实验分组实验分成两组:新鲜肝细胞组 (对照 组) : 新鲜分离获得的猪肝细胞 0.8 1010个, 活率 8
10、0%以上; 冷冻肝细胞组 (实验组) : 将 1 1010个新鲜肝细胞 (因考虑冷冻 复温洗涤后有 20%左右的肝细胞损失) 采用 4 / - 85 / - 196 的方法 8梯度降温, 最后入液氮罐 ( - 196 ) 中保存。 将在液氮中保存 1 个月的肝细胞取出,迅速浸入 39 水浴中 复温, 复温后肝细胞活率在 70%以上。 1.2.3BALSS 培养TECA-I 型 BALSS 由细胞环路、 血液环 路及中空纤维管式半透膜组成, 两个环路中的液体及中、 小分 子的物质通过中空纤维管的半透膜进行顺浓度差的交换。分 别将新鲜及冷冻复温后的猪肝细胞置于细胞环路 (生物反应 器) 中循环培养
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- 关 键 词:
- 冷冻 猪肝 细胞 生物 人工 系统 中的 生存 状态 研究
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