前列腺素E1干预大鼠血管球囊损伤后再狭窄的机制探讨.pdf
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1、前列腺素 E1干预大鼠血管球囊损伤后再狭窄的机制探讨 冯国清1, 赵 胜2, 程红梅3, 付润芳1, 刘 红1, 杨万雷1, 秦 攀1 (1. 郑州大学医学院药理学教研室, 河南 郑州 450052; 2. 杭州市萧山区 妇幼保健院儿科, 浙江 杭州 30006; 3. 郑州市食品药品监督管理局, 河南 郑州 450006) 收稿日期: 2005 -01 -02, 修回日期: 2005 -03 -11 作者简介: 冯国清 (1957 - ) , 女, 硕士, 副教授, 硕士生导师, 研究方 向: 心血管生化药理, Tel: 0371-65138689, E-mail: feng- gq202
2、yahoo. com. cn; 付润芳 (1951 - ) , 女, 教授, 硕士生导师, 研究方向: 心血 管药理, E-mail: frf zzu. edu. cn 中国图书分类号: R-332; R 322. 12; R 392. 14; R 543. 02; R 977. 6 文献标识码: A 文章编号: 1001 -1978 (2005) 07 -0876 -05 摘要: 目的 观察前列腺素 E1(PGE1)在大鼠血管球囊损伤 术后对血小板颗粒膜蛋白 (GMP-140) 、 D-二聚体 (D-dimer) 、 血浆内皮素 (ET) 及炎性细胞因子白介素-1 (IL-1) 、 白介 素
3、-6 (IL-6) 、 肿瘤坏死因子 (TNF-) 水平的影响, 探讨 PGE1 对血管球囊损伤术后再狭窄形成的防治机制。方法 采用 大鼠腹主动脉球囊损伤模型, 用药组术前连续 5d 经尾静脉 给予 PGE1(8、 24、 72 gkg -1) , 模型组及假手术组给予等 容积 NS。各组动物于术后6 h、 24 h、 10 d、 21 d 4 个时间点取 血, 采用酶连免疫吸附试验双抗体夹心法测定血浆中 GMP- 140、 D-dimer 的含量; 采用平衡法测定血浆中内皮素及血清 中 IL-1、 IL-6、 TNF- 的含量。结果 与假手术组比球囊损 伤模型组术后 6 h 血浆 GMP-1
4、40、 D-dimer 含量明显升高 (P 0. 01) , PGE1(8、 24、 72 gkg -1) 各组血浆 GMPI40 和 D- 二聚体的含量显著降低 (P 0. 01) 。模型组血浆 ET 含量 6 h 开始增加, 24 h 达高峰, 10 d 降至正常。PGE1(24、 72 g kg -1) 两组能明显降低 6、 24 h 血浆 ET 含量 (P 0. 01) 。血 管球囊损伤术后 6 h, 模型组 TNF- 含量达高峰, 而 IL-1、 IL-6 则在术后 24 h 达高峰, PGE1各组均可在高峰时显著降 低 IL-1、 IL-6、 TNF- 的含量, 与模型组相比差异显
5、著 (P 0. 01) , 并呈良好的剂量相关性 (r = 0. 747, 0. 907, 0. 747) 。 结论 PGE1在大鼠血管球囊损伤术后可降低 GMP-140、 D- dimer 及血浆中 ET、 血清中 IL-1、 IL-6、 TNF-a 水平的作用, 是其干预血管再狭窄形成的重要机制。 关键词: 前列腺素 E1; 球囊损伤; 血小板颗粒膜蛋白; D-二聚 体; 内皮素; 细胞炎性因子 很多基础和临床研究均表明,经皮腔内冠状动 脉成形术 (Percutaneous transluminal coronary angio- plasty, PTCA) 术后再狭窄 (Restenos
6、is, RS) 的形成机 制主要是由于血管内皮细胞及血管平滑肌细胞 (Vascular smooth muscle cell , VSMC) 受损后引起微 血栓形成及体内多种因子变化, 刺激 VSMC 迁移、 增 殖而致。因此, 找到一种安全有效、 用药简便、 能作 用于多种病理环节防治 RS 的药物在提高临床远期 疗效中具有很重要的意义。本试验在以往研究的基 础上 1 4采用大鼠腹主动脉球囊损伤模型, 术前连 续 5 d 尾静脉给予前列腺素 E1(Prostaglandin E1, PGE1) , 观察术后对血浆及血清中血小板颗粒膜蛋 白 (GMP-140) 、 D-二聚体 (D-dimer
7、) 、 内皮素 (ET) 及 白介素-1 (IL-I) 、 白介素-6 (IL-6) 、 肿瘤坏死因子 (TNF-) 水平的变化, 探讨 PGE1对 PTCA 术后 RS 形成的防治作用及其作用的机制, 以期为临床寻找 一条有效的防治 RS 途径。 1 材料 1. 1 实验动物 #Wistar 大鼠, 体重 275 325 g, 由郑州大学实验动物中心提供, 实验动物合格证号 为 410116。 1. 2 药品及试剂 前列腺素 E1粉针剂, 哈尔滨高 科技集团白天鹅药业有限责任公司生产, 批号 020701, 规格 100g支 -1; GMP-140、 D-dimer 试剂 盒, 均购自上海太
8、阳生物技术公司, 批号 MB0308; IL-1、 IL -6、 TNF、 ET 放免试剂盒, 均购自解放军总医 院东亚免疫技术研究所; SM actin MAB-0003, 福州 迈新生物技术开发有限公司试剂公司。 1. 3 仪器 HPS-A 型恒流泵, 江苏沙洲实验仪器 厂; 特制球囊导管, 上海注射针厂; 特制乳胶球囊, 北 京乳胶三厂; DG3022 酶联免疫检测仪, 中国; D- 37520 超速低温离心机, 德国; MDF-330 低温冰箱, 日本; XHF-1 高速分散器, 上海金达生化仪器厂; SN- 682 型放射免疫 计数器, 上海核福光电仪器有限 公司。 2 方法 2.
9、1 动物分组及给药方法 将体重 275 325g 的 Wistar 大鼠随机分为假手组、 球囊损伤模型组、 PGE1 (8、 24、 72 gkg -1) 组, 共 5 组, 每组 32 只; 每组又 分6 h、 24 h、 10 d、 21 d 共4 个时间点, 每个时间点各 8 只。各组均于球囊损伤术前 5 d, 每天 1 次, 以恒 流泵经尾静脉匀速等容量 (10 mlkg -1) 输入生理 678中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Jul; 21 (7) : 876 80 盐水 (NS) 或各剂量的 PGE1, 推注时间为 20
10、min, 最 后 1 次给药 24 h 后手术。 2. 2 大鼠血管球囊损伤模型的建立 5 将最后一 次给药 24 h 的大鼠用 3% 的戊巴比妥钠 (1. 5 ml kg -1) 经腹腔注射麻醉, 仰卧固定于大鼠手术板上, 作颈部正中切口逐层分离皮下组织及肌肉, 暴露左 颈总动脉, 4 号丝线结扎动脉近头侧, 可见左颈总动 脉充盈, 除假手术组仅做左颈总动脉结扎外余各组 均用动脉夹钳夹闭动脉近心侧, 取中间段作一斜切 口, 由此插入特制的球囊导管约 3 cm 处有一落空感 时, 即改变进针方向, 沿胸主动脉走向继续向下插入 约 10 cm, 可感到有阻力, 即达髂动脉分叉处, 此时 向球囊内
11、注入 0. 15 ml 生理盐水, 使其充盈 (直径约 0. 4 cm) 至回拉导管有轻度阻力, 然后回拉导管使 球囊达颈总动脉分叉处, 再负压回抽球囊中的生理 盐水, 使球囊恢复原状, 再次进入髂动脉分叉处; 调 换导管方向, 重复上述过程共 3 次。退出导管并结 扎左颈总动脉, 逐层缝合颈部切口。 2. 3 GMP-140、 D-dimer 的测定 球囊损伤术后 6 h 各组大鼠心脏取血2 ml, 全血与2% EDTA 二钠以 9 : 1 体积混合抗凝, 2 500 rmin -1离心 15 min 分 离血浆, 放置 -20冰箱保存, 按试剂盒说明采用酶 联免疫吸附试验双抗体夹心法定量检
12、测。 2.4 血浆 ET 含量的测定 大鼠心脏取血 2 ml, 全 血与 7. 5%的 EDTA 二钠 30 l 和抑肽酶 40 l 混 匀, 超速低温离心机 3 000 rmin -1, 离心 10 min, 分离血浆后, 放置 -20冰箱保存。标本收集完毕, 采用平衡法按放免试剂盒说明测定血浆 ET 含量。 2. 5 炎性细胞因子的测定 大鼠心脏取血 2 ml 后, 分离血清, 放置 -20冰箱保存, 按试剂盒说明 用平衡法测定血清中 IL-1、 IL-6、 TNF- 的含量。 2. 6 统计学分析 计量资料数据用$x s 表示, 应 用统计软件 SPSS10. 0 进行方差齐性检验, 若
13、方差不 齐, 采用平方根反正弦或对数变量变换, 达到方差齐 性要求后再作方差分析。以 =0. 05 为检验水准。 3 结果 3. 1 PGE1对 GMP-140、 D-dimer 含量的影响 球 囊损伤模型组术后6h 可见血浆 GMP-I40 和 D-dimer 的含量明显升高, 均较假手术组差异显著 (P 0. 01) , PGE1(8、 24、 72 g. kg -1) 各组均可使血浆 GMP-140 和 D-dimer 的含量与模型组比较显著降低 (P 0. 01, Tab 1) 3.2 PGE1对血浆 ET 含量的变化的影响 假手术 组血浆 ET 含量稳定, 球囊损伤模型组术后 6 h
14、 血浆 ET 含量开始增加, 24 h 时达高峰, 10 d 降至正常; PGE1(24、 72 gkg -1) 两组在 6 h、 24 h、 10 d 3 个 时间点血浆 ET 含量均较模型组显著降低 (P 0. 01) , PGE1(8 gkg -1) 组血浆 ET 含量仅在 24 h、 10 d 显著降低 (P 0. 01) , 见 Tab 2。 3. 3 PGE1对炎性细胞因子的影响 3. 3. 1 PGE1对不同时间点血清 IL-1 含量的影响 假手术组血清 IL-1 含量 6 h 较高, 随时间呈渐 降变化; 球囊损伤模型组术后 6 h 血清 IL-1 含量 开始升高, 24 h
15、达高峰, 与假手术组相比差异显著 (P 0. 01) , 于 10 d 降至正常状态; PGE1(24、 72 g kg -1) 两组 IL-1 在 6 h 低于模型组 (P 0. 05) , 在 24 h PGE1(8、 24、 72 gkg -1) 组均有降低 IL-1 的作用 (P 0. 05) , 并在 24h 呈现较好的剂量相关 性 (r =0. 747) , 见 Tab 3。 3. 3. 2 PGE1对不同时间点血清 IL-6 含量的影响 假手术组24 h 血清 IL-6 的含量最高, 与其他时间 点比较差异显著 (P 0. 01) ; 模型组 24 h 血清 IL-6 达高峰,
16、与假手术组比较差异显著 (P 0. 01) ; PGE1(8、 24、 72 gkg -1) 各组在 24 h 与模型组比 较 IL-6 水平均显著降低 (P 0. 05) , 同时, 在该时间 点呈现良好的剂量相关性 (r =0. 907) , 见 Tab 4。 3. 3. 3 PGE1对不同时间点血清 TNF- 含量的影 响 假手术组血清 TNF- 含量稳定; 模型组术后 6 h 血清 TNF- 明显升高, 与假手术组相比差异有显 著性 (P 0. 01) ;PGE1(8、 24、 72 gkg -1) 各组术 后 6 h 血清 TNF- 含量与模型组相比均显著降低 (P 0. 01) ,
17、 并具有较好的剂量相关性 (r =0. 747) , 见 Tab 5。 Tab 1 The concentration of GMP-I40 and D-dimer at 6h after operation ($x s, n =8) GroupDose/ gkg-1GMP-140/ gL-1ConversionD-dim/ mgL-1Conversion ShamNS4.27 0.542.17 0. 1314. 41 1. 461. 16 0. 44 ModelNS143.67 8.39&11.98 0. 35172. 10 16. 72&2. 23 0. 43 PGE18 99.27 3.
18、989.96 0. 20146. 98 15. 522. 17 0. 45 PGE124 92.10 3.489.60 0. 1881. 95 8. 931. 91 0. 51 PGE172 96.35 4.139.81 0. 2163. 59 9. 191. 80 0. 64 &P 0. 01 vs sham;P 0. 01 vs model 778中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Jul; 21 (7) Tab 2 The concentration of ET in each group at each time point (n
19、gL -1 ($x s, n =8) GroupDose/ gkg-16 h24 h10 d21 d ShamNS4.61 6.1835.70 3. 2535. 06 1. 3435. 90 3. 11 ModelNS47.32 6.12&73.02 7. 56&37. 77 3. 9535. 23 2. 61 PGE1843.20 4.99 33.66 4. 2331. 84 4. 0434. 94 3. 01 PGE124 32.73 4.5834.91 1. 7129. 29 2. 2234. 93 2. 70 PGE172 41.81 4.0429.30 3. 231. 42 3. 2
20、834. 13 2. 53 &P 0. 01 vs sham;P 0. 05 vs model;P 0. 01 vs model Tab 3 The concentration of IL-1 in each group at each time point (mgL -1, $ x s, n =8) Group Dose / gkg -1 6 h24 h10 d ShamNS0.07 0.010.06 0.020.06 0.02 ModelNS0.08 0.0120.29 0.01&0.07 0.01 PGE180.08 0.01 0.27 0.010.07 0.02 PGE124 0.06
21、 0.020.14 0.020.06 0.02 PGE172 0.05 0.010.14 0.020.06 0.02 &P 0. 01 vs sham;P 0. 05 vs model;P 0. 01 vs model Tab 4 The concentration of IL-6 in each group at each time point (mgL -1, $ x s, n =8) Group Dose / gkg -1 6 h24 h10 d ShamNS149.20 8.61220.17 35.00#129.93 7.57 ModelNS162.81 8.58394.14 26.4
22、8&159.57 14.79& PGE18162.05 6.24 340.20 43.30148.10 18.69 PGE124162.30 12.41 242.71 20.45161.70 14.68 PGE172 120.61 11.85199.05 21.91146.01 12.10 &P 0. 01 vs sham,P 0. 05 vs model;P 0. 01 vs model; #P 0. 01 vs sham 6 h, 10 d Tab 5 The concentration of TNF-in each group at each time point (mgL -1, $
23、x s, n =8) Group Dose / gkg -1 6 h24 h10 d ShamNS1.32 0.211.54 0.171.53 0.24 ModelNS3.99 0.19&1.60 0.321.54 0.30 PGE18 3.34 0.241.61 0.161.54 0.34 PGE124 1.73 0.271.52 0.441.52 0.33 PGE172 1.66 0.291.47 0.331.53 0.23 &P 0. 01 vs sham;P 0. 01 vs model 3 讨论 大量的研究显示 6, 7, PTCA 术后再狭窄主要包 括血栓形成、 内膜增生及血管重塑
24、 3 个相对独立又 互相联系的过程。在 PTCA 术后再狭窄的形成过程 中, 血小板聚集、 早期血栓形成为 VSMC 的增殖提供 了所需的空间, 并起到了骨架的作用, 同时血栓的溶 解产物和血栓中的单核/ 巨噬细胞能促进 VSMC 的 增殖, 对再狭窄的发展过程具有重要的意义。 GMP-140 是细胞粘附蛋白, 具有介导白细胞粘 附至内皮细胞和活化血小板表面的作用, 因而血浆 GMP-140 增高亦可作为内皮损伤的一个指标, 同时 也是血小板活化的一个新的特异性指标 8, 在启动 和扩大血栓形成过程中具有重要的意义, 活化的血 小板在冠脉损伤处粘附、 聚集形成血栓, 引起冠脉血 流量减少, 一
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