不同舌苔舌上皮细胞的凋亡及相关基因分子机理研究.pdf
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1、中国中西医结合杂志2 0 0 5 年 1 1 月第 2 5 卷第 1 1 期 C J I T WM, N o v e m b e r 2 0 0 5 , V o l . 2 5 , N o . II 不同舌苔舌上皮细胞的凋亡及相关基因分子机理研究 吴正治 李 明 张盛薇2 蔡英3 张永锋 陈馒菌 摘要目的探讨不同舌苔舌上皮细胞凋亡及其相关基因表达的关系。方法运用末端脱氧核普酸转 移酶介导的脱氧尿啥咤核普三磷酸缺口末端标记技术、 原位杂交、 免疫组化和图像分析技术, 检测常见舌苔 舌上皮细胞凋亡及凋亡相关基因b a x , f a s , T G F - 那 m R N A和蛋白产物。结果 4
2、种常见舌苔其舌上皮细胞 均可见细胞凋亡发生, 不同舌苔变化趋势与凋亡指数变化趋势相反。与正常及薄苔比较, 剥苔b a x , f a s 基因 过度表达伴随细胞凋亡增多, 而厚苔b a x , T G F - 邓m R N A低表达伴随细胞凋亡减少。舌苔上皮细胞中 促凋 亡基因b a x , f a s , T G F - 那表达水平变化趋势与细胞凋亡水平变化趋势一致。结论凋亡相关基因b a x , f a s , T G F - 那表达水平的变化可能是影响舌苔上皮细胞凋亡, 并导致不同舌苔变化的重要原因。 关键词舌苔; 原位缺口末端标记技术; 原位杂交; 免疫组织化学; 图像分析 S t u
3、 d y o n t h e Mo l e c u l a r Me c h a n i s m o f L i n g u a l E p i t h e l i a l C e l l A p o t o s i s a n d i t s R e l a t e d G e n e s i n D i f f e r e n t T o n g u e F u r s WU Z h e n g - z h i , L l Mi n g , S h e n g We i , e t a l C l i n i c a l I n s t i t u t e o f I n t e g r
4、a t i v e T r a d i t i o n a l C h i n e s e a n d We s t e r n Me d i c i n e o f S h e n z h e n C i t y , G u a n g d o n g( 5 1 8 0 3 1 ) A b s t r a c t O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f l i n g u a l e p i t h e l i a l c e l l ( L E C )
5、 a p o p t o s i s a n d i t s r e l a t e d g e n e s e x p r e s s i o n i n d i f f e r e n t t o n g u e f u r s . Me t h o d s T h e L E C a p o p t o s i s a n d i t s r e l a t e d g e n e s e x - p r e s s i o n i n c l u d i n g b a x , f a s , T G F - 月 3 m R N A a n d p r o t e i n p r o
6、d u c t i n t o n g u e f u r w a s d e t e r m i n e d u s i n g t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e - m e d i a t e d d e o x y u r i d i n e t r i p h o s p h a t e n i c k e n d l a b e l l i n g t e c h n i q u e ( T U N E L ) , i n s i t u h y b r i d i z a t
7、i o n , i mm u n o h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e a n d i m a g e a n a l y s i s . R e s u l t s L E C a p o p t o s i s c o u l d a l w a y s b e s e e n i n 4 t y p e s c o m mo n l y e n c o u n t e r e d t o n g u e f u r . T h e t e n d e n c y o f c h a n g i n g i n t h i c k n
8、e s s o f t o n g u e f u r w a s o p p o s i t e t o t h a t o f a p o p t o t i c i n d e x . C o m p a r e d w i t h n o r m a l t h i n f u r , b a x a n d f a s g e n e s w e r e o v e r - e x p r e s s e d i n e x f o l i a t i v e f u r w i t h i n c r e a s e d a p o p t o s i s , w h i l e
9、i n t h i c k f u r , b a x a n d T G F - R 3 g e n e s w e r e l o w - e x p r e s s e d a n d a c c o m p a n i e d w i t h d e c r e a s e d a p o p t o s i s . T h e l e v e l o f a p o p t o s i s p r o m o t i n g g e n e s , b a x , f a s , T G F - 俘3 g e n e e x p r e s s i o n i n L E C s h
10、 o w e d a t e n d e n c y p a r a l l e l t o t h a t o f L E C a p o p t o s i s . C o n c l u s i o n C h a n g e o f a p o p t o s i s r e l a t e d g e n e s e x p r e s s i o n , b a x , f a s a n d T G F - 俘 3 m a y e f f e c t t h e L E C a p o p t o s i s a n d b e t h e i m p o r t a n t f
11、 a c t o r f o r c h a n g i n g o f t h e t h i c k n e s s o f t o n g u e f u r . K e y w o r d s t o n g u e f u r ; T U N E L ; i n s i t u h y b r i d i z a t i o n ; i mm u n o h i s t o c h e m i c a l ; i m a g e a n a l y s i s 舌苔变化能较为客观地反映病情, 察舌辨证能指 导临床用药 。 有关舌苔变化机理的研究虽已深人到 亚细胞水平 2 - 4 )
12、, 但在基因水平的研究尚属罕见。为 此, 本课题自2 0 0 0 年 1 月一 2 0 0 3年 1 2月运用末端脱 氧核昔酸转移酶介导的脱氧尿嚓陡核昔三磷酸( d - U T P ) 缺口末端标记技术( t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e - m e d i a t e d d - U T P n i c k - e n d l a b e l l i n g t e c h - 其金项目: 国家自 然科学基金资助项目( N o . 3 9 7 7 0 8 9 0 ) 作者 单 位: 1
13、. 广 东 省深 圳 市 中西 医结 合 临床 研 究 所 ( 广 东 5 1 8 0 3 1 ) ; 2 . 广东省深圳市中医院; 3 . 深圳市第二人民医院口腔科 通 讯 作者: 吴正治, T e l : 0 7 5 5 - 8 3 2 4 6 3 9 3 , E - m a il : z h e n g z h w ) y a h o o . n i q u e , T U N E L 技术) 检测舌苔上皮细胞凋亡情况, 并 用原位核酸分子杂交、 免疫组织化学技术对凋亡相关 基因b a x , f a s , T G F - 阳在正常及常见病理舌苔上皮细 胞中的m R N A转录水平及蛋
14、白产物进行测定, 以期从 基因分子水平阐明常见舌苔的形成机理和影响因素。 资料与方法 1 资料来源病理舌苔受检者均系深圳市第二 人民医院门诊及住院患者, 病种不限, 但注意各组病种 分布的平衡; 正常组选择无全身各系统器质性病变, 并 排除近月内舌、 口、 鼻、 咽等局部病变, 舌质淡红、 舌苔 薄白而润者。参考 中医诊断学 舌诊标准辨舌苔( 5 1 中国中西医结合杂志 2 0 0 5 年 1 1 月第 2 5 卷第 1 1 期 C J I T WM, N o v e m b e r 2 0 0 5 , V o l . 2 5 , N o . 1 1 分为4 组: 正常组 1 2例, 男 6
15、例, 女 6 例; 年龄2 4 一6 8 岁。薄苔组3 0 例, 男 1 4 例, 女 1 6 例; 年龄2 1 一7 3 岁。 厚苔组 3 0 例, 男 1 7例, 女 1 3例; 年龄 2 4 一6 8岁。剥 苔组 1 6 例, 男 7例, 女 9例; 年龄 1 9 一7 5 岁。经统计 学分析, 各组性别、 年龄分布比较差异无显著性。 取材: 每位观察对象用经高温高压消毒的丝瓜络 用力刮取舌背中部( 花剥苔者取无舌苔覆盖部位表层) 舌苔, 装于有预冷生理盐水( 含 0 . 1 % D E P C ) 的1 0 m l 具塞离心管中, 洗涤、 涂片后一 7 0 密闭保存备测。 2 主要试剂
16、抗 B a x , F a s 蛋白多克隆抗体为美 国O n c o g e n e 公司产品; 第二抗体 E n v i s i o n +、 抗体稀 释液均购自美国D A K O公司; T U N E L细胞凋亡检测 试剂盒, b a x , f a s , T G F - 叩 原位杂交检测试剂盒、 抗 T G F - 邓多克隆抗体均为武汉博士德公司产品; 二乙基 焦碳酸醋( D E P C ) 购自华美生物工程公司; 多聚- L 一 赖 氨酸为S ig m a 公司产品; 其余试剂均为国产分析纯。 3方法 3 . 1 细胞凋亡的测定 采用 T U N E L法。所有 标本涂片用 4 %多
17、聚甲醛固定 1 5 m i n , P B S洗涤 3 m i n , 共2 次, 双蒸水洗涤3 m i n , 共2 次; 3 %H 2 q 浸泡 3 0 m i n , 双蒸水洗涤 5 m i n , 共 3 次; 涂片加标记缓冲液 湿润后, 加标记液3 7 标记2 h , T B S 洗涤5 m i n , 共3 次; 加封闭液封闭3 0 m i n ; 加生物素化抗地高辛抗体, 3 7 C孵育 3 0 m i n , T B S洗涤 5 m i n , 共 3 次; 加 S A B C , 3 7 C孵育6 0 m i n , T B S 洗涤5 m i n , 共 4 次; D A
18、B显色。 阳性反应为细胞核中有棕黄色颗粒, 阴性对照( 以标记 缓冲液代替标记液) 细胞核中无棕黄色颗粒。 3 . 2 b a x , f a s , T G F - (3 3 m R N A的测定 采用原位 杂交法, 按试剂盒说明书操作。阳性杂交信号为棕黄 色, 阴性对照( 用预杂交液代替杂交液) 为无色。 3 . 3 b a x , f a s , T G F - 邓 蛋白的测定 采用免疫组 化标记葡聚糖多聚体( l a b e l l e d d e x t r a n p o l y m e r , L D P ) 法。所有标本涂片以冷丙酮固定 1 5 m i n , 双蒸水充分 洗涤
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- 关 键 词:
- 不同 舌苔 上皮细胞 相关 基因 分子 机理 研究
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