四种气管上皮细胞分离培养方法的比较研究.pdf
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1、 第 18 卷 第 10 期医 学 研 究 生 学 报Vol. 18 No. 10 2005 年 10 月Journal of Medical PostgraduatesOct. 2005 论 著 四种气管上皮细胞分离培养方法的比较研究 邓三明1, 汪 健1, 连耀国2, 倪云峰1, 卢 强1, 杨 晔1, 李小飞 1 (1. 第四军医大学唐都医院胸外科, 陕西西安 710038; 2. 空军总医院肾内科, 北京 100036) 摘要: 目的: 比较四种不同的方法在培养气管上皮细胞中的异同, 改进其培养技术, 为组织工程气管提供种子细 胞。 方法:用两步酶消化法 (使用0. 1% Dispas
2、e 4消化18h 后, 用0. 25%的胰酶37消化5min) 、 Dispase 冷消 化法 (用 0. 1%Dispase 4消化18h) 、 胰酶温消化法(0. 25%的胰酶37消化10min) 和机械刮刷法四种方法分离、 培养兔气管上皮细胞, 测定分离细胞的数量和纯度。 结果:两步酶消化法、 Dispase 冷消化法较其他两种方法得 到的气管上皮细胞纯度高, 细胞状态好; Dispase 冷消化法得到细胞数量较其他方法少, 其余三种方法得到的细胞数 统计学上不存在差异。 结论:两步酶消化法较其他方法所得细胞数量多、 纯度高、 细胞成活率高, 是一种较好的 气管上皮细胞体外分离培养方法。
3、 关键词: 气管上皮细胞; 胰酶; Dispase; 细胞培养 中图分类号: R-331 文献标识码: A 文章编号: 1008-8199 (2005) 10-0870-02* Comparison of tracheal epithelial cells culture methods in vitro DENG San-ming1,WANG Jian1,LIAN Yao-guo2,NI Yun-feng1, LU Qiang1,YANG Ye1,LI Xiao-fei1 (1. Department of Thoracic Surgery,Tangdu Hospital,the Fourt
4、h Military Medical University,Xian 710038,Shaanxi,China;2. Department of Nephrology,General Hospital of Air Force,PLA,Beijing 100036,China) Abstract: Objective: To seek an effective method to get a large amount of pure tracheal epithelial cells in vitro for tracheal tissue engineering. Methods:Four
5、kinds of methods were compared: 0. 1%dis- pase treatment for 18h at 4 and 0. 25% trypsin treatment for 5min at 37. 0. 1%dispase treatment for 18h at 4. 0. 25% trypsin treatment for 10min at 37. direct insolation. The cells from rab- bits trachea were grown in serum-free medium. Cell account/ purity
6、of the cells were compared. Re- sults:The quality and purity of cells got by the methods of 0. 1%dispase treatment for 18h at 4 and 0. 25% trypsin treatment for 5 min at 37 and 0. 1% dispase treatment for 18 h at 4 were better than those in the others. The quantity of cells gotten by 0. 1% dispase t
7、reatment for 18 h at 4 was less than those in the other three methods. The quantity of cells gotten by other methods were not different in statistics. Conclusion: The method of 0. 1%dispase treatment for 18h at 4 and 0. 25% trypsin treatment for 5 min at 37 is the best way to obtain a large amount o
8、f pure tracheal epithelial cells from rabbit in vitro. Key words: Tracheal epithelial cells; Trypsin;dispase; Dispase; Cell culture 078 *收稿日期: 2005-06-17; 修订日期: 2005-07-08 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (批准号: 39970707) ; 陕西省自然科学基金资助项目 (批准号: 99SM37) 作者简介: 邓三明 (1979- ) , 男, 陕西西安人, 医师, 医学硕士, 从事胸腔外科专业。 通讯作者: 李小飞 (1
9、961- ) , 男, 河南沁阳人, 副主任医师, 副教授, 医学博士, 从事胸腔外科专业。 0 引 言 气管移植现处于实验研究阶段 1, 2, 组织工程 气管是气管移植的重要手段。气管上皮细胞是组织 工程中不可缺少的部分, 但培养方法国内报道尚不 多。本实验在国内外相关实验基础上 3 -7, 使用两 步酶消化法、 Dispase 冷消化法、 胰酶热消化法及机 械刮刷法, 分离、 培养兔气管上皮细胞, 比较四种方 法分离培养的细胞数量、 纯度及成活率。 1 材料和方法 1. 1 动物和组织来源 1 月龄健康的雄性新西兰 兔, 体重 (300 0. 25) g。耳缘静脉空气栓塞致死, 无菌条件下
10、取出气管, 在不含 Ca2 +、 Mg2 +的 PBS 中 剔除气管周围的软组织,用含有青霉素 10 万单 位/ L、 链霉素 50 mg/ L 的 PBS 反复冲洗气管内外, PBS 浸泡待用。 1. 2 试剂 上皮细胞培养液 K-SFM (serum-free ke- ratinocyte mediem) 、 DMEM 培养液、 胎牛血清 (FBS) 、 胰酶、 Dispase 购自 Gibco 公司。 1. 3 气管上皮细胞的分离培养 用两步酶消化法、 Dispase 冷消化法、 胰酶热消化法及机械刮刷法分 离、 培养气管上皮细胞, 对所得细胞的数量、 纯度在 倒置显微镜下进行观察。两步
11、酶消化法: 将冲洗 干净的气管一端用线扎紧, 从另一端加入 0. 1% 的 Dispase 至气管微胀后扎紧, 置入 4冰箱, 18 h 后将 消化酶换成 0. 25% 的胰酶, 置入 5% CO2、 37孵箱 培养 5 min 后取出, 放出气管内消化液, 加入含 10% 胎牛血清的培养液终止胰酶反应。用 5 ml 注射器 抽吸液体反复冲洗气管内面, 收集细胞悬液于离心 管中, 800 r/ min 离心 7 min, 弃上清, 用 PBS 洗涤 1 次。用 K-FSM 培养液重悬细胞后移入一次性培养 板中, 计数细胞。置入 5%CO2, 37孵箱培养, 静置 3 天后换液, 以后隔天换液。
12、Dispase 冷消化: 步 骤与两步酶消化法相似, 将消化条件换成0. 1% Dis- pase, 4 下消化 18 h, 收集细胞悬液于离心管中。 其余步骤同两步酶消化法。胰酶热消化:步骤与 两步酶消化法相似, 将消化条件换成 0. 25% 的胰 酶, 37消化10min, 用含10%胎牛血清的培养液终 止胰酶反应。收集细胞悬液于离心管中。其余步骤 同两步酶消化法。机械刮刷法:将冲洗干净的气 管剖成两半, 用手术刀刮取气管内膜, 用 PBS 冲洗, 收集冲洗液。计数细胞。置入 5% CO2、 37孵箱中 培养, 静置 3 天后换液, 以后隔天换液。 1. 4 上皮细胞鉴定 倒置显微镜下观察
13、培养的气 管上皮细胞状态, 计数细胞。免疫组化检测气管上 皮细胞角蛋白, 操作步骤按试剂盒说明书进行。 1. 5 统计学方法 使用 SPSS10. 0 统计学软件行单 因素方差分析, 两组间比较用 LSD 方法, P0. 05 为 差异有显著性统计学意义。细胞数量以均数 标准 差 (x s) 表示。 2 结 果 免疫组化检查气管上皮细胞特有的角蛋白, 染 色阳性可证实为气管上皮细胞 2. 1 气管上皮细胞分离的比较 Dispase 冷消化得 到的细胞数量 (381780 580) 较其他方法得到的少 (P 0. 05) 。镜下观察细胞状态 差异较大。两步酶消化法、 Dispase 冷消化所得细
14、胞 纯度高。机械刮刷法所得气管上皮细胞纯度较差, 细胞中含有大量的成纤维细胞, 在以后的培养中抑 制了气管上皮细胞的贴壁与增殖, 对气管上皮细胞 培养影响较大。胰酶热消化得到的细胞不能贴壁, 不能继续培养。 2. 2 倒置显微镜下气管上皮细胞生长特征 两步 酶消化法、 Dispase 冷消化法分离的气管上皮细胞为 圆形, 折光度好, 悬浮在培养液中, 静置 3 天后在显 微镜下可见细胞贴壁, 呈铺路石样, 4 5 天后细胞 增殖, 形成小片状的细胞群, 6 8 天后小片状细胞 群逐渐融合成片。机械刮刷法所得的细胞静置 3 天 后显微镜下可见细长梭形与铺路石样细胞并存, 4 5 天细胞增殖后可见
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- 气管 上皮细胞 分离 培养 方法 比较 研究
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