利用碱性磷酸酶融合表达技术研究神经导向因子NETRIN4的功能.pdf
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1、收稿日期 2006 -01 -09 基金项目 国家重点基础研究发展计划 (973 计划) (2003CB715900) 、 国家海外青年学者合作研究基 金 (30128010) 、 国家自然科学基金重大研究计划 (90208017) 、国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 (30500147) 、 北 京 市 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目 (06G0627 ) 、北 京 市 科 技 新 星 计 划 A 类 (2005A44) 、 军事医学科学院科技创新启动基金 (0402013) 资助 作者简介 秦树桐 (1981 - ) , 男, 内蒙古自治区乌兰浩特市 人, 在读硕士,
2、 Tel: 010 -66930210。 *通讯作者 Tel: 010 - 66931590;Fax:010 - 68169574;E - mail: zhangcg bmi. ac. cn 利用碱性磷酸酶融合表达技术研究神经导向因子 netrin-4 的功能 秦树桐1,高 艳1,王利红1,周仁平2,张成岗 1* (1. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京 100850; 2. Department of Chemical Biology,Col- lege of Pharmacy,Rutgers University,Piscataway,NJ 08854,USA) 摘要 目的: 采
3、用碱性磷酸酶 (AP4) 标记技术研究 netrin-4 的神经导向功能和受体结合特征, 并评估碱性磷酸酶 作为标签分子在真核基因功能研究中的意义。方法: 将 netrin-4 全长及3 个结构域编码区 cDNA 克隆到碱性磷酸酶 表达载体 APtag4, 成功构建真核表达载体 AP4-netrin4、 AP4-LNT、 AP4-EGFL 和 AP4-NCT, 进而在 COS7 细胞中表达 出含有 AP 标签的融合蛋白, 并通过神经组织块培养技术和神经元原代培养技术对其活性进行鉴定。结果: 确认了 netrin-4 的神经突起导向功能。进一步通过对 AP 标签进行检测, 发现 netrin-4
4、 全长、 LNT 和 NCT 可与原代培养的神 经元表面相结合, 而 EGFL 不结合, 说明神经元表面含有 netrin-4 受体或结合位点, 且可能通过 LNT 和 NCT 结构域 起作用。结论: netrin-4 具有明确的神经突起导向功能, 在神经元表面含有结合位点, 同时发现碱性磷酸酶标签融 合表达技术在真核基因功能研究方面具有一定优势。 关键词 神经导向因子; netrin-4; 碱性磷酸酶; 融合表达; 基因; 神经元 中图分类号 Q78文献标识码 A 文章编号 1000-5501 (2006) 03-0209-05 Application of alkaline phospha
5、tase tag in functional study of axon guidance factor netrin-4 QIN Shu-Tong1,GAO Yan1, WANG Li-Hong1,ZHOU Ren-Ping2,ZHANG Cheng-Gang 1* (1. Department of Neurobiology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China; 2. Department of Chemi- cal Biology,College of Pharmacy,Rutgers Unive
6、rsity,Piscataway,NJ 08854,USA) Abstract Objective: To evaluate the performance of alkaline phosphatase (AP) -tagging technique in functional study of eukaryotic genes and study of the axon guidance activity and receptors of netrin-4. Methods: The cDNA sequence coding netrin-4 and the three domains w
7、ere subcloned into the alkaline phosphatase vector APtag4 to allow successfull expression of the alkaline phosphatase tagged proteins in COS7 cells. The activity of netrin-4 was identified using cultured neuronal ex- plants and neurons. Results: The netrin4 had axon guidance function. The AP4-netrin
8、4 fusion protein was also found to be able to bind to the primary cultured neuron by examining the activity of AP tag. The AP4-LNT and AP4-NCT were able to bind to the primary cultured neuron,but AP4-EGFL and AP4 alone not. Conclusion: There are receptors for netrin-4 in the surface of primary cultu
9、red neuron,and the key binding domains are LNT and NCT. The strategy using AP4-tag is a powerful technique for functional study of eukaryotic genes. Key words axon guidance factor;netrin-4;alkaline phosphatase;fusion expression; genes; neurons 基因功能研究是后基因组时代的研究重点之一。采用 新的技术策略对于加快这一过程具有重要意义。在蛋白质 功能研究方面
10、, 获得具有生物活性的蛋白并采用灵敏快捷的 检测手段是研究方法中的关键问题。以往通常采用同位素 标记蛋白质, 通过检测同位素的放射性信号研究蛋白质的功 能。近年来各种非同位素标记蛋白的策略逐渐受到人们的 重视, 如采用 -半乳糖苷酶 (-galatosidase, -gal) 、 -葡萄糖 苷酸 酶 ( -glucuronidase, -GUS) 、 荧 光 素 酶( luciferase, luc) 、 绿色荧光蛋白 (green fluorescent proteins,GFP) 、 碱性磷 酸酶 (alkaline phosphatase,AP) 等 1。而酶标策略在疾病诊 断和实验研究
11、中具有广泛应用, 其中通过将碱性磷酸酶基因 902 军事医学科学院院刊 2006 年 6 月 第 30 卷 第 3 期 Bull Acad Mil Med Sci,Jun 2006; Vol 30 No 3 与配体基因拼接并经过表达而获得融合蛋白, 在受体与配体 相互作用的研究中显示出明显优势与价值, 已陆续用于相关 基因的功能研究之中 2, 3。 netrin 家族是一类重要的神经突起导向因子, 在神经发 育过程中通过作用于轴突生长锥上的相应受体家族 DCC 或 UNC5H 来诱导或排斥轴突生长, 从而决定轴突生长路线以 及轴突与特定靶细胞的功能联系 4 8。目前在脊椎动物中 已经鉴定出 n
12、etrin 家族的 4 个成员: netrin 1 4 9 13。本实 验室曾对 netrin-4 的表达特征进行了系统鉴定, 提示 netrin-4 可能参与神经突起生长导向和神经可塑性调节过程 14 16, 但目前尚无关于 netrin-4 在神经系统中的受体及其信号转导 通路研究的报道。本研究拟利用碱性磷酸酶融合标签表达 技术对 netrin-4 及其 3 个功能结构域进行功能研究, 并评估 碱性磷酸酶标签技术在基因功能研究中的作用。 1 材料与方法 1. 1 材料 大肠杆菌 MC1061 为本室保存; 用于 PCR 扩增的模板为 本室前期构建并经测序核实的 pGBKT7-netrin4
13、 质粒; 质粒 Aptag4 由 Dr. John Flanagan(Harvard University) 惠赠; 可溶 性碱性磷酸酶底物 pNPP 和不溶性碱性磷酸酶底物 BCIP/ NBT 均购自北京中山公司; 所需的限制性内切酶、 LA Taq、 DNA 聚合酶、 T4DNA 连接酶均购自 TaKaRa 公司; 凝胶回收 试剂盒、 质粒提取试剂盒均购自 Promega 公司; 脂质体 Lipo- fectamineTM2000 购自 InvitroGen; 细胞培养所需培养基与血 清购自 Gibco。新生 Wistar 乳鼠由本院动物中心提供。 1. 2引物设计 根据人 netrin-
14、4 cDNA 序列设计 4 对引物进行 PCR 扩 增, 具体为: pAP4-netrin4-Fwd + pAP4-netrin4-Rvs 扩增 netrin- 4 全长、 pAP4-LamNT-Fwd + pAP4-LamNT-Rvs 扩增 netrin-4 N 端结构域 (层连蛋白 N 端结构域 laminin N- terminal domain, LNT) 、 pAP4-EGFL-Fwd + pAP4-EGFL-Rvs 扩增 netrin-4 表皮 生长因子 (EGF) 样重复结构域 (epidermal growth factor-like, EGFL) 、 pAP4-NetrinC
15、T-Fwd + pAP4-NetrinCT-Rvs 扩增 netrin- 4 C 端结构域 (netrin C- terminal domain, NCT) (由上海博亚 生物技术有限公司合成) , 分别对应 netrin-4 成熟肽序列及 LNT、 EGFL、 NCT 3 个功能结构域的编码序列。上游引物引 入 Bgl的酶切位点, 下游引物引入 Xho的酶切位点, 工作 浓度均为 10 mol/ L。 pAP4-netrin4-Fwd: 5-GGAAGATCTTCCCGCTGTGAAAA- A-3; pAP4-netrin4-Rvs: 5-CCGCTCGAGCTACTTGCACTCTCT-3
16、; pAP4-LamNT-Fwd: 5-GGAAGATCTTCCCGCTGTGAAAAA-3; pAP4-LamNT-Rvs: 5-CCGCTCGAGCTAGCCCTTGACAAT-3; pAP4-EGFL-Fwd: 5-GGAAGATCTTGCTTCTGCAATGGC-3; pAP4-EGFL-Rvs: 5-CCGCTCGAGCTAACATTCGCATTT-3; pAP4-NCT-Fwd: 5-GGAAGATCTGCCAAGGCATTCTGT-3; pAP4-NCT-Rvs: 5-CCGCTCGAGCTACTTGCACTCTCT-3。 上述引物对与目的基因片段的对应关系见图 1。 图 1 扩
17、增 netrin-4 及其 3 个主要结构域 cDNA 序列的引物对 1. 3重组质粒的构建与鉴定 以本室前期构建并经测序核实的 pGBKT7-netrin4 质粒 为模板, 以上述引物分别扩增 netrin-4、 LNT、 EGFL 和 NCT。 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并回收。将上述 PCR 产物 进行 Bgl与 Xho双酶切后再次回收纯化酶切片段, 与同 样经 Bgl/ Xho双酶切并回收的 APtag4 载体定向连接, 用 CaCl2法 转 化 大 肠 杆 菌 MC1061, 利 用 三 重 抗 生 素 标 记 (Amp + 、 Tet + 、 Kana + ) 筛选阳性克隆。在
18、具有相同三重抗生 素的 LB 液体培养基中培养阳性克隆 12 h 后, 提取质粒 DNA 作为模板, 利用前述引物对通过 PCR 检测目的基因, 并同时 进行 Bgl/ Xho双酶切鉴定, 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 1. 4重组蛋白的表达与碱性磷酸酶活性检测 以脂质体 LipofectamineTM2000 转染重组质粒 AP4-ne- trin4、 AP4-LNT、 AP4-EGFL、 AP4-NCT 及 APtag4 至 COS7 细 胞。每种质粒转染使用不同的脂质体/ 质粒的比例, 具体操 作步骤如产品说明所述。为避免干扰后续分光光度计检测, 使用不含酚红的 DMEM 培养液培养 COS
19、7 细胞。在转染后 每隔 24 h 取培养上清, 并全量更换培养液。收获上清后 4 离心 (8 000 r/ min) 吸上清, 加入终浓度为 0. 1%的 NaN3保存 于 4备用。将培养上清于 65加热 10 min 以灭活, 然后加 入终浓度为 12 mol/ L 的碱性磷酸酶可溶性底物 pNPP, 于 避光处 37 反应 1 h, 然后在 405 nm 处读取光密度值 (D405) , 定量检测融合蛋白的表达。 1. 5融合蛋白神经突起导向功能的检测 为检测 netrin-4 的神经突起导向功能, 利用胶原培养的 方法观察 netrin-4 浓度梯度对 Wistar 大鼠大脑皮质组织块
20、突 起生长方向的影响。首先将浓度为 5 mg/ ml 的胶原在培养 皿中包被一层, 氨化 30 min 后以 0. 1% 乙酸反复漂洗 10 次, 然后滴加 100 l 含有 AP4-netrin4 或 AP4 的培养上清于培养 皿正中央, 风干后在其上再包被一层胶原, 置 37细胞培养 箱中凝固。取出生 12 h Wistar 乳鼠大脑皮质分割为直径 0. 5 1 mm 的组织块, 环绕中心接种于培养皿中, 加入含有 10%胎牛血清的高糖 DMEM 培养液在细胞培养箱中培养 48 h。 在倒置光学显微镜下观察神经组织块突起的生长情 况。 012军事医学科学院院刊 2006 年 6 月 第 3
21、0 卷 第 3 期 1. 6融合蛋白与原代培养神经元结合的检测 分离出生12 h 内的 Wistar 乳大鼠大脑皮质神经元, 并接 种至包被有 L-多聚赖氨酸的盖玻片上, 以含有 10% 胎牛血 清、 10%马血清的高糖 DMEM 培养8 h 后换为含5%马血清、 N2、 B27 的高糖 DMEM 培养 7 d。以 4% 的多聚甲醛固定已 培养成熟的原代神经元, 然后以 PBS 漂洗细胞 3 次, 每次 5 min, 再滴加 100 l 含有 AP4-netrin4、 AP4-LNT、 AP4-EGFL、 AP4-NCT 和 AP4 的培养上清, 37 孵育 30 min 后再以 PBS 漂洗
22、 3 次。漂洗后, 以碱性磷酸酶不可溶底物 BCIP/ NBT 显 色, 再次以 PBS 漂洗后封片观察。 2 结果 2. 1 重组质粒的构建与鉴定 以构建的重组质粒 AP4-netrin4、 AP4-LNT、 AP4-EGFL 和 AP4-NCT 为模板, 通过 PCR 扩增 netrin-4、 LNT、 EGFL 和 NCT。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析, 显示扩增片段 大小正确, 其中 netrin-4 基因片段大小约为 1. 8 kb, LNT 约为 0. 7 kb, EGFL 约为0. 65 kb, NCT 约为0. 35 kb, 与预期结果相 符 (图 2) 。同时以
23、Bgl与 Xho双酶切重组质粒, 可以看到 有相应大小的片段释放 (图 3) , 说明重组质粒 AP4-netrin4、 AP4-LNT、 AP4-EGFL 和 AP4-NCT 已经构建成功。 2. 2 表达的融合蛋白具有碱性磷酸酶活性 以碱性磷酸酶可溶性底物 pNPP 检测融合蛋白的表达。 由于碱性磷酸酶与 pNPP 的反应产物呈黄色, 为避免酚红颜 色对检测造成影响, 采用无酚红培养基进行检测。通过对不 同质粒转染条件进行优化发现, 重组质粒 AP4-netrin4、 AP4- LNT、 AP4-EGFL、 AP4-NCT 及 APtag4 的最优化转染需要不同 的质粒/ 脂质体比例, 并
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