小鼠派氏集合淋巴结T细胞活化和调节性T细胞的分析.pdf
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1、 5 3 7 文章编号 1 0 0 ( 一 4 7 1 8 ( 2 0 0 6 ) 0 3 一 0 5 3 7 一 0 6 小鼠派氏集合淋巴结 T细胞活化和 调节性 T细胞的分析关 黄秀艳, 曾 耀英 ,肇静娴, ( 暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室, 王通 广东 广州 5 1 0 6 3 2 ) 摘要 目的: 通过对小鼠派氏集合淋巴 结( P P S ) 、 肠系膜淋巴结( M L N s ) 和腹股沟淋巴结( I L N s ) 的比较性研 究, 以分析P P s T 细胞活化和调节性T 细胞的功能特点。 方法: 无菌分离小鼠P P s , M L N s 和I L N s , 分别
2、制备单个淋巴 细胞悬液, 运用流式细胞术结合荧光抗体染色技术来检测C D 3 十 T 细胞、 C D 3 + C D 4 + 辅助性T 细胞和C D 4 十 C D 2 5 十 调节 性T 细胞的比例; 用多克隆刺激剂刀豆蛋白A ( C o n A ) 、 佛波醇P H ( P D B ) 和离子霉素( I o n ) 刺激活化淋巴细胞, 随后运 用流式细胞术结合双色荧光抗体染色技术来检测T 细胞早期活化标志C D 6 9 的表达水平。 结果二 P P S 内C D 3 十 T 细胞 所占比例明显低于M L N s 和II N S , 然而C D 4 十 C D 2 5 + 调节性 T 细胞的
3、比例明显高于M L N S 和 I L N s ; 在没有加入刺激剂 的培养条件下, P I 、 来源的T 细胞C D 6 9 的表达水平明显高于M L N s 和I L N s 来源的T 细胞, M L N s 来源的T 细胞C D 6 9 的表达水平明显高于I L N s 来源的T 细胞; 而在加人C o n A 或者单纯P D B 的培养条件下, P P S 来源的T 细胞却表现出 低反应性; 在加人P D B 十 I o n 的培养条件下, 3 者来源的T 细胞 C D 6 9 的表达水平没有明显差别。 结论: P P S 内C D 3 T 细胞所占比例较低, C D 4 C D 2
4、5 + 调节性T 细胞的比例较高, 这可能是P P S 整体T 细胞低反应性的原因之一; P P S 来源 T 细胞的高基础活化率可能与其不断接触小肠来源的食物和共生菌抗原有关; P P S 来源T 细胞选择性地对某些刺激 剂表现出低反应性, 提示这群细胞处于某种程度的无能状态。上述特征的生物学意义在于避免因为不断接受小肠 来源的食物和共生菌抗原的刺激而发生病理性炎症的同时还保留 对病原微生物抗原的应答。 关键词 淋巴 集结; T 淋巴细胞; 淋巴细胞转化; 小鼠 中图分类号 8 3 6 3 文献标识码 A y s i so f T c e l l a c t i v a t i o n a
5、n d r e g u l a t o r y T c e ll d e r i v e d f r o m m u r i n e P e y - e r s p a t c h e s H U A N G X i u 一 y a n , Z E N G Y a o一y t n g Z H A O J i n g 一x i a n,WA N G T o n g ( T h e K e y L a b o r a t o r y of M in i s t r y of E d u c a t io n f o r T is s u e T r a n sp la n t a t io n 国
6、家自 然科学青年基金资助项目 ( N o . 3 0 5 0 0 4 6 6 ) 通讯作者T e l : 0 2 0 一 8 5 2 2 6 2 1 9 ; E 一 m a i l : t z e n g y y 00 加 . e d u . c n t i c s m e n t i o n e d a b o v e c o n t r i b u t e t o p re v e n t p a t h o l o g i c a l i n fl a m m a t i o n s a n d m a i n t a i n t o l e r a n c e t o e n t e
7、r i c a n t i g e n s s u c h a s f o o d p ro t e i n s a n d c o m m e n s a l b a c t e r ia b u t s i m u l t a n e o u s ly r e ta in p ro p e r im m u n e r e s p o n s e s t o p a t h o g e n ic m i c ro b e s . K E YW O R D S P e y e r s p a t c h e s ; T 一 ly m p h o c y t e s ; 切 m p h o c
8、 y te t r a n s f o r m a t i o n ; M i c e 肠粘膜免疫系统由于其独特的生理解剖位置而 要接触更多的抗原 。因 此, 区分开人侵病原微生 物和无害的食物及共生菌抗原成为肠粘膜免疫系统 的 特殊而繁重的 任务。 肠相关淋巴 组织( g u t 一 a s s o c i - a te d ly m p h o id tis s u e , G A L T ) 是由 特化的 聚 集的 淋巴 组 织和广泛分散的淋巴细胞组成 2 ,3 1 。聚集的淋巴样 组织包括: 派氏 集合淋巴结 ( P e y e r s p a t c h e s , P P s )
9、, 肠系 膜淋巴 结( m e s e n t e r i c l y m p h n o d e s , M L N s ) 及一些 小的分散的淋巴样滤泡, 由于这些组织和细胞参与 免疫应答的启动或耐受的诱导, 所以被称为“ 诱导” 部位( “ i n d u c t i v e “ s i t e s ) ; 散在的免疫细胞包括: 位于 粘膜固有层的淋巴细胞以及镶嵌在肠粘膜上皮细胞 之间的 淋巴 细胞( i n t r a e p i t h e l i a l l y m p h o c y t e , I E L ) , 因为 它们负责免疫应答效应者功能的实施, 因此被称为 “ 效应者
10、” 部位( “ e ff e c t o r “ s i t e s ) 。肠道中正常的适应 性免疫应答在很大程度上依赖于 P P S 和 M L N s 中的 C D 4 十 T 细胞( h e l p T c e ll s , T h ) 。如图7 所示, P P S 是 沿着小肠纵向分布的位于粘膜下的微小淋巴样组 织。成熟的P P S 是由面积较大的B 细胞滤泡区、 镶 嵌于滤泡区 外的 胸腺依赖区( t h y m u s 一 d e p e n d e n t a r e a , T D A ) 以及直接位于肠上皮下的被称为上皮下弯隆结 构( s u b e p i t h e l
11、i a l d o m e , S E D ) 组成。 P P S 与肠腔只有被 称为滤泡相关上皮( fo ll ic le 一 a s s o c ia te d e p ith e liu m , F A E ) 的单细胞层相隔。F A E的最大特征是镶嵌有M 细胞。M细胞从肠细胞分化而成, 具有抓取病原微 生物的能力。传统的理论认为肠免疫应答的独特性 反映在它对作为免疫应答的诱导部位的P P S 的绝对 依赖上。近年的发现正在挑战上述传统概念 4 ,5 1 0 正是基于此原因, 我们对小鼠P P s 来源的C D 4 十 T 细 胞的活化和调节性 T 细胞进行了研究。 材料和方法 1 材
12、料 清洁级B A I .B / c J ( H一 2 砂, I 一 A d , 以下简写为 B A L B / c ) 近交系小鼠, 雄性、 1 2 周龄, 体重( 2 3 士 2 ) 9 , 购自 广东省医学实验动物中心。刀豆蛋白A ( C o n A ) , P D B ( P h o r b o l 1 2 , 1 3 - d i b u t y r a t e ) , L 一 谷氨酞胺、 p 一 二琉基乙 醇均购自 美国S ig m a 公司 。 I o n o m y c in ( 简称I o n ) 购自 美国C a lb i o c h e m公司。R P M I 一 1 6 4
13、 0 , 胎牛血清( f e t a l c a l f s e ru m , F C S) 购自美国 G i b c o - B R L 公司。 抗小鼠C D 3 一 P E ( p h y c o e r y t h r in ) , C D 6 9 - F I T C ( fl u o r e s c e in i s o t h i o c y a n a t e ) 、 C D 3 一 A P C ( a l l o p h y c o - c y a n in ) , C D 4 一 P E 一 C y 5 和C D 2 5 一 F T I C 单克隆抗体 ( m o n o c
14、l o n a l a n t i b o d y , m A b ) 购自 美国B D - P h a r M i n g e n 公司。F A C S C a l i b u r 流式细胞仪, 为美国B e c t o n D i c k - in s o n 公司产品。 2 方法 2 . 1 淋巴细胞悬液的制备将 B A L B / c J 小鼠断髓 处死, 无菌分离 P P s , M L N s 和腹股沟引流淋巴结( i n - g u i n a l l y m p h n o d e s , I L N s ) , 分别置于3 个盛有预冷 P B S 的无菌平皿中, 去掉被膜,
15、于4 0 0目 筛网过滤除 去细胞团块, 收集细胞, 制备单细胞悬液, 用冷P B S 离心( 3 0 0 x g , 5 m i n ) 洗涤细胞2 次, 弃上清。 然后用 含1 0 % 胎牛血清、 5 x 1 0 一 “ m o l/ L 二琉基乙 醇, 6 0 m g / L 卡那霉素的R P M I 一 1 6 4 0 完全培养基重悬细胞并调 整细胞浓度为4 x 1 0 9 c e l l s / L o 2 . 2 3色免疫荧光标记结合流式细胞仪检测及分 析淋巴细胞组成 从上述新鲜制备的单细胞悬液中 各取出1 x 1 护个细胞进行 3 色荧光标记, 加人抗小 鼠C D 3 一 A P
16、 C , C D 4 一 P E 一 C y 5 和C D 2 5 一 F 1 T C 单克隆 抗体1 f g , 混匀后4 避 光作用3 0 m i n 。以P B S 离心 洗涤细胞1 次, 重悬于3 0 0 匹的P B S 中, 立即 上机检 测。全部数据经 F A C S C a l i b u r 流式细胞仪和 C E L - L Q u e s t 软件获取。 F I T C 为荧光1 ( F L l ) , P E 一 C y 5 为 荧光2 ( F L 2 ) , A P C 为荧光4 ( F I 4 ) , 先在前散射( F S C ) 对侧散射( S S C ) 二维散点图
17、中划出淋巴细胞区R 1 , 在F I A对S S C中划出C D 3 十 细胞区R 2 , 然后在F L 3 对 S S C中划出C D 4 十 细胞区R 3 , 再在F L l 对F 1 3的散点 图中划出 C D 4 - C D 2 5 一 、 C D 4 - C D 2 5 十 、 C D 4 + C D 2 5 + 和 C D 4 十 C D 2 5 - 4 个象限, 该散点图的细胞群来自R 1 x R 2 x R 3区的细胞, 即 C D 4 + T细胞群, 对 C D 4 + C D 2 5 + 区和 C D 4 十 C D 2 5 一 区细胞群进行荧光强度检测, 用 C D 4
18、+ C D 2 5 + / C D 4 十 C D 2 5 + + C D 4 + C D 2 5 , 即获得调 节性 T 细胞占C D 4 + T 细胞的比例。同样的方法来 检测并分析派氏集合淋巴结, 肠系膜淋巴结和腹股 沟引流淋巴结中C D 3 + 淋巴细胞占总细胞的比例, 以 及C D 4 + T 细胞占总T 细胞的比例。每管样品检测 2 0 0 0 ( 个细胞, 获得的数据用C E L I 习 u e s t 软件分析。 2 . 3 刺激淋巴细胞活化及 T细胞活化率的检测和 分析将上2 . 1 中调整好细胞浓度的淋巴细胞接种 于9 6 孔培养板, 分别设置单纯佛波醇醋类多克隆刺 激剂P
19、 D B ( 终浓度2 x 1 0 - m o U L ) 组、 佛波醇醋类多 全部淋 巴细胞的 6 1 . 5 9 % 土8 . 7 3 %和 6 4 . 5 9 % 士 6 . 9 8 %, 然而, 就 C D 4 + T 细胞占全部 C D 3 + T细胞的 比 例而言, P P s , M L N s 和I L N s 之间没有明显差别, 分 别为 7 6 . 4 2 %土 4 . 4 0 %、 7 3 . 4 0 %土6 . 2 3 %和 7 3 . 7 4 % 土 5 . 7 5 %. P P s 来源的C D 4 十 C D 2 5 + 调节性T 细胞的 比例明显高于M L N
20、s 和 I L N s 。如图3 所示, P P S 来源 的C D 4 + C D 2 5 + 调节性 T细胞占 C D 4 十 T细胞的 1 3 . 6 0 % 1 2 . 0 7 %, 而 M L N s和 I L N s 来源的 C D 4 十 C D 2 5 + 调节性T 细胞分别占C D 4 + T 细胞的6 . 9 2 %士 1 . 0 8 %和7 . 8 1 %士 0 . 9 1 %。 2 P P s , ML N s 和I L N s 来源的T细胞体外活化分析 结果 在没有加人刺激剂的培养条件下, P P S 来源的 C D 3 + T细胞 C D 6 9的表达水平明显高于
21、M L N s 和 I L N s 来源的C D 3 + T 细胞, M L N s 来源的C D 3 + T 细胞 C D 6 9 的表达水平明显高于 I L N s 来源的 C D 3 + T细 胞。如图5 所示, P P s , M L N s 和 I L N s 来源的T 细胞在 没有加人刺激剂的培养条件下, C D 3 + C D 6 9 + T 细胞/ C D 3 十 T细胞的百分比分别为 2 3 . 1 8 % 1 4 . 1 0 %, 1 4 . 6 6 %士 2 . 1 0 %和 1 1 . 2 1 %土 0 . 5 9 %。这表明P P s 来源的T 细胞体内 基础活化率高
22、于M L N s 和I L N s 来 源的T 细胞, 而且M I N s 来源的T 细胞体内活化率又 高于I L N s 来源的T 细胞。 C o m p a r a t i v e s t u d i e s o n T c e l l p o p u l a t i o n s f r o m d i f f e r e n t t i s s u e s 1 P P s , ML N s 和I L N s 来源的T细胞亚群比较性分 析结果 免疫表型分析结果表明, 在P P S 内C D 3 十 T 细胞 所占比 例明显低于M L N s 和I L N s , 如图I 所示, P P S
23、 来 源的C D 3 + T细胞只占全部淋巴细胞的 1 9 . 9 9 %士 1 . 4 6 %, 而M L N s 和I L N s 来源的C D 3 十 T 细胞分别占 岁万-吕冶签司lu。d 克隆刺激剂P D B ( 终浓度2 x 1 0 - 7 m o l / L ) + 钙离子转 运 剂I o n ( 终 浓度0 . 5 m g / L ) 组、 植物血凝素 类多克隆 刺激剂C o n A ( 终浓度1 0 m g / L ) 组和P B S 对照组, 并 分别设置复孔, 定容2 0 0 P L / w e l l 。 在3 7 c C , 5 %C 仇 条件下培养1 2 h 。 取
24、出培养细胞, 离心( 3 0 0 x g , 5 m i n ) , 收集培养上清于 E P管中用来检测细胞因子。 细胞经P B S 离心( 3 0 0 x g , 5 m i n ) 洗涤2 次后, 重悬于 5 0 匹 的P B S 中, 进行双色免疫荧光标记, 加人抗 C D 3 一 P E 和抗C D 6 9 一 F 17 单克隆抗体 1 l g / 1 0 6 c e l l s , 混匀后4 避光作用3 0 m i n 。以P B S 离心洗涤 细 胞1 次, 重悬于3 0 0 .L 的P B S 中, 立即上机检测。 全部数据经F A C S C a l i b u : 流式细胞仪
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- 小鼠 集合 淋巴结 细胞 活化 调节 分析
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