延迟整流钾通道在人AGS胃癌细胞的表达及KV15对AGS细胞生长的影响.pdf
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1、书书书 论 著 延迟整流钾通道在人 AGS 胃癌细胞的表达及 Kv1.5 对 AGS 细胞生长的影响 兰 梅 时永全 韩者艺 郝志明 潘阳林 樊代明 摘 要 目的 观察9 种延迟整流钾通道在人 AGS 胃癌细胞的表达及下调 Kv1.5 表达对 AGS 细胞生长的影响。方法 用 RT- PCR 方法检测 Kv1.1、 Kv1.2、 Kv1.3、 Kv1.5、 Kv1.6、 Kv2.1、 Kv2.2、 Kv3.1 和 Kv3.2 亚单位在 AGS 细胞的表达; 用间接免疫荧光法证实 Kv1.5 的蛋白表达后, 采用小干扰 RNA (siRNA) 下调 Kv1.5 表达, 用 MTT 及流式细胞术观
2、察其对细胞生长、 细胞周期分布的影响。结 果 在 AGS 细胞中可检测到7 种延迟整流钾通道的表达, 其中 Kv1.3、 Kv1.5 和 Kv2.1 的 mRNA 水平较高, Kv1.6 和 Kv3.1 的水平较 低。间接免疫荧光法证实 Kv1.5 主要表达于 AGS 的细胞膜上。用 siRNA 下调内源性 Kv1.5 的表达后, AGS 细胞生长明显减慢, 细胞 阻滞于 G1期, 细胞增殖指数明显降低。结论 在 AGS 细胞中有多种延迟整流钾通道的表达, Kv1.5 可能通过对细胞周期的影响而 参与胃癌细胞的增殖调节。 关键词 延迟整流钾通道; 胃肿瘤; 逆转录聚合酶链反应; RNA 干扰;
3、 细胞增殖 中国图书资料分类号 R329.28 Expression of delayed rectifier potassium channels in AGS cells and the effects of down-regulation of Kv1.5 on AGS cell proliferation Lan Mei, Shi Yongquan, Han Zheyi et al. Institute of Digestive Diseases, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi an 710032, Ch
4、ina Abstract Objective To study the expression of 9 delayed rectifier potassium channel subunits in human gastric cancer cell line AGS, as well as the effect of down-regulation of the expression of Kv1.5 on AGS cells proliferation. Methods RT-PCR technique was employed to detect the mRNA expression
5、of Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1, Kv2.2, Kv3.1 and Kv3.2 in AGS cells. Once the expression of Kv1.5 protein was confirmed by immunofluorescence, small interference RNA(siRNA)was applied to down -regulate the Kv1.5 protein expression, then MTT assay and flow cytometry were used to observe
6、the cell proliferation and the cell cycle distribution. Results Totally 7 delayed rectifier potassium channel subunits were detected in AGS cells,among them the mRNA levels of Kv1.3,Kv1.5 and Kv2. 1 were much higher than that of the others. It was confirmed by immunofluorescence that the Kv1.5 prote
7、in was expressed mainly in AGS cytomem- brane. After the endogenous Kv1.5 expression in AGS cells was down regulated by siRNA, the cell proliferation obviously slowed down and the cell growth stopped in G1 period. Conclusion Multiform expression of delayed rectifier potassium channel subunits existe
8、d in AGS cells, and Kv1.5 may be involved in the regulation of gastric carcinoma cell proliferation by modulating the cell cycle. Key words delayed rectifier potassium channels;stomach neoplasms;reverse transcription polymerase chain reaction;RNA interfer- ence; cell proliferation 延迟整流钾通道属电压门控性钾通道 (
9、voltage-ga- ted potassium channel, Kv) 家族, 具有电压依赖、 慢失活 或不失活、 对 4-AP 敏感等特性。目前已知除 eag、 KC- NQ 家族外, Kv1 Kv3 家族多数成员编码的电流具有 延迟整流样特性 1, 2。延迟整流钾通道不仅在可兴奋 细胞普遍表达, 而且在肿瘤细胞也有表达, 并与肿瘤细 胞的增殖有关 3。我们的前期研究也证实在 SGC7901 胃癌细胞中存在着与细胞增殖有关的延迟整流性钾电 流 4, 5, 但有关 Kv 家族成员在胃癌细胞系表达及功能 方面的研究较少, 为此本研究观察了9 种延迟整流钾 通道 亚单位在人 AGS 胃癌细胞
10、的表达及 Kv1.5 与 胃癌细胞增殖的关系, 以期为胃癌发生、 发展及逆转治 疗提供一定的理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和细胞株 siRNA 表达载体 mU6pro 6为 美国密西根大学 Turner 教授惠赠。该载体含有 RNA U6 启动子。人胃癌细胞系 AGS 为本研究所实验室保 存。 1.1.2 主要试剂 细胞总 RNA 提取试剂 Trizol 为 In- vitrogen 公司产品; M-MuLV 反转录酶为 MBI 公司产 品; 一管便捷式 PCR 扩增试剂盒购自天为时代; 羊抗人 Kv1.5 多抗为 Santa Cruz 公司产品; 抗 -actin
11、 的单抗 为 Sigma 公司产品; FITC 及辣根过氧化物酶标记的兔 抗羊二抗购自北京中山生物技术有限公司; FuGENE6 为 Roche 公 司 产 品;T4DNA 连 接 酶 及 各 种 作者简介: 兰 梅, 医学博士, 副教授, 副主任医师。主要从事肿瘤缺氧信 号转导方面的研究。已发表论文10 余篇 作者单位: 710032 西安 第四军医大学西京医院全军消化疾病研究所 (兰 梅、 时永全、 韩者艺、 郝志明、 潘阳林、 樊代明) 基金项目: 国家自然科学基金资助课题 (编号30100079) 907 解放军医学杂志 2005 年8 月 第30 卷 第8 期 Med J Chin
12、PLA Vol 30 No 8 August 2005 限制性 DNA 内切酶均购自 TaKaRa 公司; 小量质粒提 取试剂盒购自 Omega 公司; 噻唑蓝 (MTT) 为华美公司 产品。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 人 AGS 胃癌细胞系生长于含10% 小牛血清的 RPMI 1640 培养液中, 于 37、 5%CO2培 养箱中培养。 1.2.2 RT-PCR 按试剂盒说明书完成 AGS 细胞 RNA 的抽提纯化和 cDNA 的合成。所使用的各引物序列见 表1。PCR 反应体系为 50l, 反转录产物 1l, 上下游 引物各2l, 2 Taq PCR master mix 25l
13、。PCR 反应条 件: 94 5min; 94 96 45s 1min, 50 58 45s 1min, 72 45s 1min, 共30 个循环; 72 10min; 4保 存。-actin 的条件为 95 1min, 94 40s, 56 40s, 72 40s, 26 个循环; 72 10min。之后, 各取20l PCR 扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳, UVP 紫外凝胶成像 仪上观察照相。 表1 RT-PCR 扩增时所使用的各延迟整流钾通道成员的 引物序列及反应参数 Table 1 Primer sequences for rectified delayed potassium ch
14、annels used for RT-PCR 基 因引物序列 (5-3) 片段大小 (bp) 定位 退火温度 () Kv1.1 5-ccatgaccactgtaggatac-3 5-cgatctccatgtactcatac- 3 2681 104 1 37251 Kv1.2 5-aaaggtctccagattctagg-3 5-actaatggtagaggcacttc-3 4291 429 1 85851 Kv1.3 5-cggttcttcgcttgtcctag-3 5-ctggcaatgcgatggtcaag-3 4901 160 1 65055 Kv1.5 5-tctcggtcttggtt
15、atcctc-3 5-tggccaccacatcgatgatg-3 330919 1 24958 Kv1.6 5-ggtcattctcatctccatag-3 5-ccaccaagtcaatgatgttc-3 3621 411 1 77351 Kv2.1 5-ctgtctgaaaccagctcaag-3 5-gaagaaactagagtgctggc-3 4771 482 1 95954 Kv2.2 5-catcagtaccatcctcttag-3 5-tgacttcactcacagcatgg -3 3712 840 3 21152 Kv3.1 5-gaggacgagctggagatgac-3
16、5-ggcagaagatgacacgcatg-3 367501 86855 Kv3.2 5-gctgtagtgaccatgactac-3 5-tggtactagagcgtctgatg-3 4061 290 1 69654 -actin 5-ggccgggacctgactgactac-3 5-tctttgcggatgtccacgtc-3 309684 99360 1.2.3 间接免疫荧光法 AGS 细胞在固化好多聚赖 氨酸的盖玻片上生长到约80%融合, PBS 冲洗10min 3 次, 95%乙醇室温固定 30min, 固定细胞用 PBS 冲洗 10min 3 次后, 加 0.3%Triton
17、X-100 室温 10min, 正常 山羊血清 37 封闭 10min, 加入羊抗人 Kv1.5 多抗 (1:100) 4孵育过夜。PBS 溶液洗涤 10min 3 次, 加 入1:100 的 FITC 标记的兔抗山羊 IgG, 37孵育 2h。 PBS 洗10min 3 次, 荧光显微镜观察照相。 1.2.4 Kv1.5-siRNA 的构建和细胞转染 特异性 siRNA 的设计: 以 GenBank 收录的 Kv1.5 的基因序列 作为分析序列, 根据 siRNA 的设计原则, 合成两对特异 的 siRNA 靶序列, 以保证 RNAi 对 Kv1.5 的抑制效率。 具体为: siRNA1:5
18、-tttgagatgttgatgtggacgcacagcgtcca-cat- caacatctcttttt-3, 5-ctagaaaaagagatgttgatgtggacgctgtg-cgtc- cacatcaacatct-3; siRNA2:5-tttgatactcgaagataagcc-aacat- ggcttatcttcgagtatcttttt-3, 5-ctagaaaaagatactcgaag-ataagc- catgttggcttatcttcgagtat-3。siRNA 表达载体的构建: 取 等量的100mmol/ L 的正反义寡核苷酸片段, 在退火缓 冲液 (1mol/ L NaC
19、l, 100mmol/ L Tris, pH7.4) 中于95 保温5min 后, 缓慢降至室温, 将退火后的双链 siRNA 与 Bpil 和 Xba 线性化的 mU6pro 载体16连接过夜, 转化 DH5 感受态细胞, 挑取单菌落, 采用 Hind 和 Xba 双酶切鉴定重组质粒, 测序正确后, 进行下一步的 细胞转染实验。细胞转染与鉴定: 将 AGS 细胞接种 于24 孔板, 待细胞生长至60% 70%融合时, 采用 Fu- GENE6 转染试剂, 分别将 Kv1.5-siRNA1、 Kv1.5-siRNA2 及空载体 mU6pro 转入 AGS 细胞, G418 选择性培养液 培养3
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