抑制细胞周期依赖性蛋白激酶5表达对C型尼曼皮克病小鼠的神经保护作用.pdf
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1、堕皇煎丝壅瘟苤查! ! ! ! 生筮! ! 鲞筮! 塑 抑制细胞周期依赖性蛋白激酶一5 表达对C 型 尼曼一皮克病小鼠的神经保护作用 郝又国张曼徐金枝李俐娟 魏佳军王雪贞 摘要目的:观察抑制细胞周期依赖性蛋白激酶5 ( c d k 5 ) 的表达对C 型尼曼一皮克病( N P C ) 小鼠( n p c “一) 的治 疗作用。方法:采用携带c d k 5 特异性小干扰R N A ( e d k 5 s i R N A ) 的重组腺相关病毒r A A V c d k 5 - s i R N A - G F P ,对出生三 天内的n p c 。一小鼠进行双侧侧脑室注射,以r A A V G F P
2、 注射组及非手术的同龄n p c 小鼠为对照( n = 6 1 0 组) ;采用 免疫组织化学染色、H E 染色和小鼠衣架悬挂试验来评价小鼠脑内的神经病理改变和运动功能。结果:r A A V 2 c d k 5 一s i R - N A G F P 能显著减少轴突球状体的数量,延缓浦肯野细胞的死亡并改善n p c 。一小鼠的运动功能。结论:降低e d k 5 的活 性对n p c 。一小鼠的神经元有一定的保护作用。 关键词C 型尼曼一皮克病细胞周期依赖性蛋白激酶5细胞骨架蛋白过度磷酸化小分子干扰R N A 重组腺 相关病毒 中图分类号:R 7 4 1 0 2 文献标识码:A文章编号:1 0 0
3、 6 3 5 1 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 6 5 5 一0 4 T h en e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t so fc y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e 一5 ( c d k 5 ) i n h i b i t i o ni n N i e m a n n - P i c kD i s e a s eT y p eCm i c e H A O Y o u g u o ,Z H A N GM i n ,X UJ i n z h i ,e ta t D e p a r t m e n to fn
4、e u r o l o g y ,T o n g j iH o s p i t a l ,T o n g j iM e d i c a lC o l l e g e ,H u a z h o n gU n i v e r s i t yo f S c i e n c ea n dT e c h o l o g y ,W u h a n4 3 0 0 3 0 ,C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e :T oi n v e s t i g a t et h en e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t so f
5、c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e - 5 ( c d k 5 ) i n h i b i t i o n i nN i e - m a n n P i c kD i s e a s eT y p eC ( N P C ) m i c e ( n p e 一7 一) M e t h o d s :R e c o m b i n a n ta d e n o - a s s o c i a t e dv i r u sc a r r y i n gt h es m a l li n t e r f e r i n g R N A ( s i R N A
6、 ) s p e c i f i cf o rc d k 5g e n ew a si n j e c t e di n t op o s t n a t a ld a y3n p c - ,一m i c ei n t r a c e r e b r o V e n t r i c u l a r l y ,t h er A A V G F P i n j e e t e da g e m a t c h e dn p c 一7 一m i c ea n dn o n s u r g e r ya g em a t c h e dn p c 一7 一m i c ew e r ee m p l o
7、 y e da sc o n t r o l ( n = 6 一l O g r o u p ) I m 。 m u n o h i s t o c h e m i s t r y ,H Es t a i n i n ga n dm o u s ec o a th a n g e rt e s tw e r ea d o p t e dt oe v a l u a t et h en e u r o p a t h o l o g ya n dm o t o rf u n c t i o ni n n p c 一7 一m i c e R e s u l t s :r A A V c d k 5
8、- s i R N A G F Ps i g n i f i c a n t l yr e d u c e dt h en u m b e ro fa x o n a ls p h e r o i d ,d e l a y e dP u r k i n j e n e u r o n d e a t h a n da m e l i o r a t e dm o t o rd e f e c t si nn p c 一。m i c e C o n c l u s i o n :I n h i b i t i o no fc d k 5a c t i v i t yh a sn e u r o
9、p r o t e c t i v ee f f e c to nn e u r o d e g e n e r a t i o ni nN P C K e yw o r d s N i e m a n n - P i c kD i s e a s eT y p eC C y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e - 5 ( c d k 5 )C y t o s k e l e t o nh y p e r p h o sp h o r y l a t i o n S i R N AR e c o m b i n a n ta d e n o a s s o
10、c i a t e dv i r u s ( r A A V ) C 型N i e m a n n - P i c k 病( N i e m a n n - P i c kd i s e a s et y p e C ,N P C ) 是一种常染色体隐性遗传的神经变性疾病。 人类和小鼠N P C 神经元变性及脱失的机制目前仍不 清楚,有研究显示:细胞周期依赖性蛋白激酶( C y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e s ,C d k s ) 家族中e d k 5 、c d c 2 和c d k 4 的 激活或异位与本病的神经元死亡有着密切联系。1 。 本研究
11、中,作者采用小片段R N A s 干扰技术( s m a l li n t e r f e t i n gR N A ,s i R N A ) 特异性沉默c d k 5 基因的表达,观察 c d k 5 活性抑制对n p c 。一小鼠神经系统病变的影响。 基金项目:国家自然科学基金项目( 3 0 6 7 0 7 3 7 ,3 0 4 0 0 1 4 1 ) ,武汉市青年 科技晨光项目( 2 0 0 5 5 0 0 3 0 5 9 ) 作者单位:4 3 0 0 3 0武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院 神经内科 通讯作者:张曼 材料与方法 6 5 5 1 动物与分组 杂合型n p cm 1
12、“B a l b c 而“小鼠( n p e “一) 购自美国 J a c k s o nL a b o r a t o r y 。子鼠出生后第3 周用P C R 技术鉴 定基因型H 1 。留取纯合型子鼠( n p e 一) 供研究,并 随机分为三组:非手术组( 下称空白组) ,r A A V 2 一G F P 注射组( 下称对照病毒组) 和r A A V 2 c d k 5 s i R N A G F P 注射组( 下称实验病毒组) ,每组6 1 0 只,雌雄比例 为1 :1 。 2 重组腺相关病毒 r A A V c d k 5 一s i R N A - G F P 和r A A V 2
13、- G F P 来源于我 们的前期研究成果“ 1 ,由北京本元正阳公司具体包 装。 万方数据 6 5 6 3 抗体 S M l 31 抗体购自S t e r n b e r g e rM o n o c l o n a l s ,I n c 公 司,稀释度1 :5 0 0 ,生物素偶联的二抗( 1 :5 0 0 ) 及辣 根过氧化物酶记的链亲和素抗生物素蛋白( 1 :5 0 0 ) 购自U P s t a t e 公司。 4 成像系统 B X 4 0F 4 显微镜和D P I O 数码相机购自O l y m p u s 公司。 5 侧脑室注射 r A A V ( 滴度1 1 0 1 2p f
14、u ) 对出生后3 天的小鼠进 行双侧侧脑室缓慢注射,每侧2 u l 。 6 免疫组织化学染色 注射8 周后处死小鼠,冰上迅速取脑后沿正中矢 状线切开,右侧放入8 0 。C 冰箱保存作生物化学分析 用;左侧O T C 胶充分包裹后置于- 8 0 。C 异戊烷3 分钟, 切成l O p 。m 厚的冰冻切片,A B C 法完成S M l 3 1 染色, D A B ( 3 ,3 7 D i a m i n o b e n z i d i n e ,二氨基联苯胺) 显色,苏 木素复染。 7 动物体重及行为学测定 本观察采用盲法,由对手术分组不知情的人员完 成。自4 周起每周称体重一次直至第8 周处死
15、。在称 重的同时用衣架悬挂试验评定小鼠肢体的运动能力。 具体做法如下:将小鼠放在离实验台2 0 厘米的衣架 上,记录小鼠悬挂的时间( h a n g i n gt i m e ) 并评分,评分 标准如下1 : 悬挂方式评分 1 爪1 2 爪2 3 爪3 4 爪 4 4 爪+ 尾或4 爪平衡正立 5 4 爪+ 尾,移动到横梁末端 6 4 爪+ 尾,爬到衣架斜边 7 4 爪+ 尾,爬到衣架顶端 8 观察两分钟,不到两分钟以具体时间记录,以评分 和时间的乘积进行统计分析。 8 轴突球状体和存活浦肯野细胞计数 S M l 3 1 免疫组化染色后收集n p e 。一小鼠脑内2 个 不同区域( 图3 a
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