维生素A酸对小鼠囊胚TGF-β1蛋白表达的影响.pdf
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1、J o u r n a l o f Ma t h e m a t i c a l Me d i c i n e Vo l . 1 9 NO. 52 0 0 6 文章编号: 1 0 0 4 - 4 3 3 7 ( 2 0 0 6 ) 0 5 - 0 4 7 0 - 0 3中圈分类号: R -3 3文献标识码: A 基拙医学研究 维生素A酸对小鼠囊胚T G F - 肛蛋白表达的影响 谭新提黎 艳张端莲 ( 武汉大学医学院人体解剖与组织胚胎学系武汉4 3 0 0 7 1 ) 摘要: 目的: 探讨T G F - 肛细胞因子对着床前胚胎发育的作用, 从而探讨A T R A对着床前期胚胎发育毒性作用, 为
2、其致崎机 理提供实验依据. 方法: 通过促超排卵, 获取妊娠3 . 5 d 小鼠囊胚, 随机分成三组, 即对照组( 空白) 、 实验1 组( 含i lA m o l / L的A T R A ) 和 实验2 组( 含1 0 p m o 1 / L的A T R A ) , 分别培养在含。 , 1 K m o 1 / L和l O K m o l / L的A T R A的M1 9 9 培养基中, 培养2 4 h , 然后再吸出囊胚。 用 免疫组织化学S - P法, 分别检测不同剂量组A T R A对小鼠囊胚T G F -肛蛋白表达的状况, 利用H P I A S - 2 0 0 0 图像分析系统测定T
3、 G F - 斑蛋白在以上三组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。 结果: T G F - 斑蛋白在囊胚细胞中的表达, 实验1 组与对照组囊胚T G F - 斑 蛋白表达的阳性面积率及平均光密度有显著性差异( P 0 . 0 1 ) ; 实验2 组与空白组和实验1 组相比均存在显著性差异( P 0 . 0 1 ) . 结 论: 细胞因子 T G F - 肛在胚胎发育的调节中发挥了重要作用. 关挂词: 全反式维生素 A酸; 转化生长因子书1 ( T G F - 9 1 ) : 囊胚; 小鼠 维生素A酸( R e t i n o i c a c i d , R A) 即视黄酸, 是维生素A即 视黄
4、醇( r e t i n a l , R O L ) 在体内氧化代谢的一类具有生物活性的 产物。 此外, 维生素A酸在临床上也是用来治疗座疮和其他许 多皮肤病的重要药物。 同时它也是用于一些恶性肿瘤联合治 疗的药物之一, 如卵巢癌、 乳腺癌、 白血病及肺癌等. 但维生素 A酸也是公认的致畸因子, 许多动物实验已经证实在妊娠期 间服用维生素A酸对胎儿的发育可产生重要的影响。 R A对 囊胚的这种致畸效应可能由于其诱导l C M和T E细胞过渡凋 亡所致. 而R A诱导囊胚细胞凋亡目前尚未见报道. 本研究通 过免疫组织化学方法研究 T G F - 斑蛋白在囊胚细胞中的表达。 1 材料与方法 1 .
5、 1 材料 1 . 1 . 1 试验动物一级健康昆明种小白鼠( S P F级) , 由武汉 大学医学院动物试验中心提供。 1 . 1 . 2 主要试剂和仪器孕马血清( P MS G ) 和人绒毛膜促性 腺激素( H C G) 为天津生物制品厂产品; A T R A购自上海第六 制 药 厂; p r o p o d i u m i o d i d e ( P I )和 b i s b e n z i m i d e ( H o e c h s t 3 3 2 5 8 ) 以及T r i t o n - 1 0 0 均系美国S i g m a 公司产品; M1 9 9 培养 基为美国H y c l
6、 o n e 公司的产品; 浓缩型兔抗人T G F - 队多克隆 抗体D A B显色试剂盒及多聚赖氨酸均购自北京中山技术公 司; 超敏即用型S - P通用型免疫组织化学试剂盒系福州迈新 公司产品。 12 方法 1 . 2 . 1 小鼠囊胚的获取 选用本校动物中心提供的一级健康昆明种小白鼠, 雌雄 各4 0 只, 体重( 3 。 士5 ) g , 光照、 黑暗各1 2 h , 自由摄食、 饮水。 于 雌鼠腹腔注射1 0 U P MS G, 4 8 h 后再腹腔注射l O U H C G促超排 卵, 当晚与雄鼠1 : 1 合笼. 次日晨检查阴栓, 见阴栓者记妊娠0 天。 于妊娠3 . 5 d 时,
7、 将孕鼠脱臼处死, 放人7 5 %酒精中浸泡消 毒约5 m i n , 于超净工作台上取出子宫, 由阴道端擂人7 号针头 注人M1 ”培养基, 冲出囊胚, 一侧子宫可获取约1 0 - 2 0 个。 将 一十 州卜琦 +曰 卜,月卜卜 冲一. 叫 卜冲 一一+一 卜. 弓一卜. 刊 卜译一 卜 十-+ -卜十一卜. 叫 卜一+一州 卜冲 定和治疗有重要作用, 测定P 1 6 , n m 2 3 可作为判定食管鳞状细3 胞癌患者预后的重要指标。 K a n b A, G r u i s N A, We a v e r F J , e t a l . p o t e n t i a l l y i
8、n v o l v e d i n g e n e s i s o f m a n y A c e l l t um or c y c l e r e g u l a t o r t y p e s . S c i e n c e , 1 9 9 4 , 2 6 4 : 4 3 6 - 4 4 0 . T a k e u c h i H, Oz a wa S , An d o N, e t a l . Al t e r e d a n d c y c l i n D I / P R A D - 1 g e n e p r o g n o s is o f s q u a m o u s c e
9、 l l p 1 6 / MT S 1 / C D K N 2 a s s o c i a t e d wi t h t h e c a r c i n o m a o f t h e e s o p h a g u s . C l i n C o m p l e x s t r u c t u r e a n d al. .考文 S t o n e S , B a n g P , D a y a n a n t h P , e t r e g u l a t i o n o f t h e p 1 6 ( MT S 1 ) l o c u s . 2 9 8 8 2 9 9 4 . L e
10、o n e A, F l o t o w U, K i n g C R, e t a l . C a n c e r R e s , 1 9 9 5 , 5 5 ( 1 4 ) : C a n c e r Re s , 1 9 9 7 , 3 ( 1 2 P t1 ) : 2 2 2 9 - 2 2 3 6 . 王永康, 陈景寒, 杜德利, 等. 食管麟癌p 5 3 和n m 2 3 蛋白联合表达的 预后价值. 中华病理学杂志, 1 9 9 9 , 5 : 3 7 5 - 3 7 6 . Re d u c e d t u mo r m e t a s t ic p o t e n t ia l
11、 , a n d c y t o k i n g r e s p o n s iv e n e s s o f t r a n s f e c t e d m e l a n o m a c e l l s . C e l l , 1 9 9 1 , 6 5 a 2 5 -3 5 . i n c i d e n c e , n m2 3 一 收稿日期: 2 0 0 6 - 0 4 - 0 7 武昌杨因铁四院医院内 二科 4 7 0. 数理医药学杂志2 0 0 6 年第1 9 卷第5 期 所有的囊胚冲人凹皿中, 并用P B S 洗涤囊胚5 m i n X 3 次。 所有 操作均在解剖显微镜下进行
12、. 1 . 2 . 2 胚胎培养 将所有囊胚随机的分为3 组, 即对照组( 空白) 、 实验1 组 ( 含1 IL m o l / L的A T R A ) 和实验2 组( 含1 0 1i m o 1 / L的A T R A ) , 将囊胚培养在3 5 m m F a l c o n 塑料培养皿中, 每皿加人l m l 培养 基, 含有2 0 个囊胚, 实验1 组中加人1 K m o l / L的A T R A, 实验2 组中加人l O t c m o l / L的A T R A, 所有 A T R A均溶于0 . 0 2 %的 D MS O。 对照组只加等童的0 . 0 2 %的D MS O。
13、 每组培养基均加 人0 . 3 % B S A, 1 m m o l / L谷氛酞胺, 并置人3 7 C, 5 % C O z 培养 箱内培养2 4 h 。 所有操作均在解剖显微镜下进行. 1 . 3 免疫组织化学S - P 法检测T G F - 印相关抗原 在解剖显微镜下, 用毛细管吸出囊胚, 并用P B S 洗涤5 m i n X3 次, 随后立即固定于4 %多聚甲醛3 0 m i n , 再用 P B S洗涤 5 m i n X 3 次, 最后转到涂有多聚赖氮酸的玻片上, 干燥2 4 h 待 用。 免疫组化S - P法主要步骤: 将载有囊胚的玻片用蒸馏水洗涤5 m i n X 3 次;
14、2 结果 (2 ) l y o t r ir o n X - 1 0 0 作用1 0 m i n , 增加抗体的穿透性, 燕馏 水洗涤5 m i n X 3 次, 3 %过氧化氢, 3 7 1C 孵育1 0 m i n以抑制内源性过氧化 物酶活性, 蒸馏水和P B S 各洗4 X 5 m i n ; 正常羊血清3 7 C 孵育3 5 m i n以减少非特异性反应, 甩 、 匆, 干, 一抗( T G F - p 1 , 1 : 1 0 0 ; ) 3 7 C 孵育1 h , 4 C 过夜。 第二天 于3 7 下复温1 h , P B S洗4 X 5 m i n ; 生物素标记的二抗, 3 7
15、1C 孵育4 0 m i n , P B S 洗4 X 5 m in ; 链每菌抗生物素蛋白 一 过载化物醉复合物3 7 C 孵育4 0 m i n , P B S洗4 X 5 mi n ; 8Q D A B 一 双权水显色1 0 m i n , 自来水冲洗终止反应; 苏木精复染, 脱水, 透明, 封片。 阴性对照用P B S 代替一抗, 其余同上。 1 . 4 结果判断 1 . 4 . 1 T G F - 队相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳 性反应, 阴性对照组除细胞核染成蓝色外, 胞核和胞浆内无棕 黄色反应物. 1 . 4 . 2 利用H P I A S - 2 0 0 0 高清晰度
16、彩色病理图文报告管理系 统对T G F - 肛的表达进行定盆分析, 每张标本随机选取5 个完 整而不重盈的高倍镜视野( X4 0 0 ) , 测定每个视野下阳性反应 的平均光密度、 阳性反应面积和所有细胞总面积, 计算阳性面 积率。 以每例5 个视野的平均光密度、 阳性面积率的平均值作 为该例的测童值. ( 阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/ 单位面积 中细胞的总面积X1 0 0 %) 1 . 5 统计学处理 对各组结果作单因素方差分析和S N K - q 检验, 检验水准 a 为0 . 0 5 . 2 . 1 T G F - 班蛋白 表达结果 T G F - 爪蛋白免疫反应阳性细胞呈棕
17、黄色, 阳性物质分布 囊胚所有细胞的细胞浆, 细胞核呈蓝色, 并根据棕黄色顺粒分 布的密度和着色深浅分为阴性、 弱阳性、 阳性和强阳性4 级。 本 实验发现在对照组, 囊胚细胞胞浆中可见少量浅棕黄色颗粒, 呈弱阳性着色, T G F - 肛蛋白表达呈弱阳性; 在实验1 组中, 囊胚 细胞胞浆中可见较多棕黄色颗粒, 且均匀分布, T G F - 班蛋白 在实验1 组囊胚细胞中表达呈阳性; 实验2 组中囊胚细胞胞浆 中可见很多均匀分布的棕黄色颗粒, T G F - 肛蛋白呈强阳性表 达。 图像分析结果显示, 试验1 组囊胚细胞T G F - 母蛋白表达的 平均光密度为。 . 1 2 0 3 , 试
18、验2 组囊胚细胞 T G F - 队蛋白表达的 平均光密度为0 . 1 9 2 4 , 对照组囊胚 T G F - 斑蛋白表达的平均光 密度为0 . 0 7 9 6 ; 试验1 组囊胚细胞T G F - 似蛋白表达的阳性面 积率为。 . 1 4 5 3 , 试验2 组囊胚细胞T G F - 肛蛋白表达的阳性面 积率为0 . 2 1 6 7 , 对照组囊胚T G F - 邵蛋白表达的阳性面积率为 0 . 0 7 5 2 。 经单因素方差分析, 组间有显著性差异( P 0 . 0 1 ) 。 经 4 检验, 对照组与实验1 组囊胚T G F - 队蛋白表达的阳性面积率 及平均光密度有显著性差异(
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