Kibra和aPKC在中枢神经系统发育_中的表达及意义硕士学位论文.doc
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1、华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文分 类 号 学号200248(师资班)学校代码 10487 密级 硕士学位论文Kibra和aPKC在中枢神经系统发育中的表达及意义学位申请人: 周金安学 科 专 业:病理学指 导 教 师:段亚琦 副教授答 辩 日 期:2013年5月2IA Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of MedicineExpression and significance of Kibra and aPKC in central nerv
2、ous system during embrynic development Candidate: Zhou Jinan Tutor: Prof. Duan YaqiMajor: Pathology Tongji Medical College ofHuazhong University of Science and TechnologyWuhan, Hubei 430030, P.R.ChinaMay, 2013独创性声明本人郑重声明,本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成
3、果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名:日期: 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密 ,在_年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。(请在以上方框内打“” )学位论文作者签名: 指导教师签名: 日期: 年 月 日 日期: 年 月 日目
4、录一、摘要1中文摘要12 英文摘要4二、正文1 前言62 材料与方法83 结果3.1 HE染色结果113.2 Kibra结果123.3 aPKC结果194讨论265结论276 参考文献28三、综 述1 综述312 结语413参考文献42四、致谢48华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文Kibra和aPKC在中枢神经系统发育中的表达及意义华中科技大学同济医学院硕士研究生 周金安导师 段亚琦中文摘要概述Kibra是一个含有WW结构域,表达于肾脏和脑组织的蛋白质。通过基因组单核苷酸多态性筛选证实,Kibra参与了人类记忆认知功能。大量研究表明,Kibra表达在记忆相关的脑组织区域;在记忆提取
5、的过程中,Kibra等位基因会发生明显改变;Kibra与CLSTN2表达在记忆相关区域内颞叶部位参与情节记忆的形成,与阿尔默海茨病病因有关。但是Kibra在脑组织中的表达部位以及在胚胎发育过程中Kibra表达部位和表达水平的变化与记忆形成的关系尚不明确。PKC(蛋白激酶C)作为一个苏氨酸-丝氨酸家族蛋白,参与了机体很多的生理性和病理性过程。如:脑组织的发育、突触的可塑性、癫痫病、脑缺血以及神经细胞的死亡。aPKC(非典型蛋白激酶C)为蛋白激酶C家族中的一个类型,可以分为三个亚型,PKC、PKC/、PKM。这些亚型在突触可塑性和神经变性疾病中发挥了重要的作用。它们介导胞外信号调节的激酶级联反应,
6、P70S6激酶信号级联反应,参与肿瘤的发生,细胞极性的形成以及记忆的长时程增强。大脑记忆的主要功能区域在海马,其次为颞叶和小脑,因为Kibra和PKC在胚胎发育脑组织中的具体表达部位及其意义还未阐明,如果能证实它们表达于大脑这些与记忆相关的区域,能为记忆形成的机理研究打下一定基础。同时,最近研究发现,Kibra与PKC关系密切,可能是PKC磷酸化的底物。本研究以大鼠不同发育时期的脑组织(不同胚胎期、新生、成年)为研究对象,通过HE染色了解脑组织的基本结构和细胞形态;阴道抽液法确定受孕日期;免疫组织化学方法检测Kibra和aPKC在不同时期脑组织中的表达,从而探讨二者在突触可塑性和记忆形成的联系
7、。结果显示:1、Kibra在大脑皮层、海马、小脑的细胞核中表达;在10d、12d表达阴性,14d表达弱阳性,16d、18d、新生、成年大鼠阳性表达逐渐增强。2、aPKC在大脑皮层、海马、小脑细胞的细胞连接处表达,且在各个时期脑组织均为阳性表达。目的 1、掌握了解大鼠脑组织的形态结构和组织特点。2、研究Kibra和aPKC在不同时期的大鼠脑组织中的表达。3、初步探讨Kibra和aPKC在大脑记忆形成中的相关性。方法1、将雌雄成年鼠合笼,阴道抽液确定怀孕日期(检查到精子记为怀孕0.5天)。2、收集不同时期(胚胎第10d, 12d, 14d, 16d,18d, 20d)胚胎鼠、新生鼠及成年鼠各两只,
8、共16只,分别标记、取脑组织。3、固定标本并切片(做冰冻切片和石蜡切片二种),HE染色、同一时期的大鼠脑组织分别用ABC三步法免疫组织化学法进行Kibra和aPKC染色。结果1、Kibra在大脑皮层、海马、小脑的细胞质中表达;在胚胎10d、12d表达阴性;胚胎第14d在大脑皮层表达弱阳性,胚胎第18d在大脑皮层表达阳性,海马区表达弱阳性;新生鼠在大脑皮层、海马、小脑的浦肯野细胞中表达阳性。随着胚胎的发育,表达逐渐增强。2、aPKC自胚胎第10d在大脑皮层、海马、小脑细胞的细胞连接处表达阳性且均在各个脑组织时期表达阳性,随着胚胎发育,表达有逐渐增强的趋势。结论 1、Kibra较aPKC晚表达于脑
9、组织中,Kibra在脑组织中的表达随胚胎发育逐渐增强,表达区域逐渐扩大。2、aPKC在自胚胎早期即表达于脑组织,说明是脑组织发育不可缺少的成分。3、Kibra和aPKC自新生后均在脑组织海马、大脑皮层和小脑中表达,提示了二者可能存在潜在的相互作用和联系,参与了记忆的形成。关键词:记忆形成;脑组织;Kibra;aPKC; 免疫组化;HE染色Expression and significance of Kibra and aPKC in central nervous system during embrynic developmentCandidate : Zhou Jinan Supervis
10、or: Prof.Duan YaqiTongji Medical College,Huazhong University of Science and TechnologyABSTRACTSummarize The Kibra gene encodes a cytoplasmatic protein, a member of the signal transduction protein family, expressed mainly in the brain. Recent studies have implicated the involvement of a genetic varia
11、tion in the KIBRA gene (T allele) in human memory in normal subjects and in the risk of developing Alzheimers disease (AD). PROTEIN KINASE C (PKC) is an integral part in the cell signaling machinery. Biochemical and molecular cloning analysis has revealed that, like most other signaling proteins, th
12、e enzyme comprises a large family with multiple isoforms exhibiting individual characteristics and distinct patterns of tissue distribution. The biological significance of this heterogeneity has not been fully clarified, but the function of each PKC isoform for cellular regulation is being investiga
13、ted extensively. Presently, the possibility may not be ruled out that some isoforms represent simply a redundancy, but plausible evidence suggests that the members of this enzyme family are activated in specific intracellular compartments in different ways, depending on various membrane lipid metabo
14、lites, and play distinct roles for the control of major cellular functions.Objective The aim of our study was to investigate the morphological structure and features of organization in brain tissues. The expression of Kibra and aPAC in brain tissues were detected as well. MethodsThe female and male
15、rats were mated and dates of pregnant were confirmed by vaginal fluid. The brain tissues of fetuses rats (10 d, 12 d, 14 d, 16 d, 18 d, 20 d), neonatal rats and adult rats at different stages were collected. Routinely processed 4% formamint-fixed, frozen sections and paraffin-embedded blocks were ar
16、chived. Kibra and aPKC were staining by HE and ABC immunohistochemical methods.ResultsKibra was expressed in the nuclei of cerebral cortex, hippocampus and epencephalon. The expression levels of Kibra were negative on day 10, 12, weakly positive on day 14. The expression level was gradually increase
17、d in neonatal rats and adult rats. The expression of aPKC was positive in the adherens junctions of cerebral cortex, sea horse and epencephalon at different period of brain tissues. Conclusion1、In brain tissues, the expression of Kibra is later than aPKC.The expression level and area of Kibra increa
18、ses with the embryonic development.2、aPKC is an indispensable component of brain development because it expresses in brain tissue in early embryon.3. Colocalization of Kibra and aPKC in the cerebral coretex, hippocampus and cerebellum may implicate their roles in memory formation.Key words: engraphi
19、a; Kibra; aPKC; immunohistochemistry; HE stainingKibra和aPKC在中枢神经系统发育中的表达及意义前 言人类记忆的形成在神经生物界至今是一个谜。一些研究者对记忆的获得、维持和再现的机制仍在寻求答案。记忆的形成是一个高度复杂的过程,需要各种蛋白质分子的相互作用参与。其中,情节记忆是人类对过去特定的时间特定经验信息的一个储存1。情节记忆50%是由遗传获得2,但是个体情节记忆的遗传差异的机制尚不清楚。动物实验研究表明,个体间的记忆遗传差异归功于记忆形成过程中记忆相关信号分子3。在这些相互作用的分子中,Kibra是一个近期研究比较热门的分子,通过运用
20、单核苷酸多态性的基因组相关研究表明,Kibra与人类情节记忆有关。最近的研究结果也一再显示了Kibra在记忆形成过程中的重要性4, 5。Kibra是一个含有WW-结构域的蛋白分子,表达于肾脏和脑组织中6。在海马及颞叶这些与记忆高度相关的区域高度表达7, 8。Kibra被证实涉及到情节记忆形成的过程中,如信号转导,突触可塑性,长时程增强及突触传递6, 7, 9。Kibra还通过与多种分子相互作用参与到多种生理功能中,如:信号传导、细胞极性的分化、细胞的迁移、囊泡递质的运输、转录的调节10等。在乳腺癌MCF7细胞中Kibra还与DLC1共同激活雌激素受体11,对乳腺癌的治疗、预后有一定的指导意义。
21、PKC是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族的一个成员,通过磷酸化反应来调节许多的细胞功能12。根据其结构和功能将PKC分为12种亚型。aPKC由于缺少Ca离子和二酰甘油结合区,故激活机制不同于其他PKC。aPKC可分为三种亚型:PKC、PKC/、PKM。三者的结构如综述图1所示。aPKC包含调节区和催化区二个结构域,PKC、PKC/在催化区有高度相关性,研究发现,这二种亚型在基因敲除小鼠不同表型中发挥的作用是不同的。敲除PKC/的小鼠由于胚胎早期细胞极性的缺陷在胚胎期死亡,而敲除PKC的小鼠却可以存活。说明,在胚胎发育中PKC/对细胞极性的建立至关重要,而PKC不参与这个过程13。在各种细胞中,PKC参
22、与MAPK级联反应;活性突变的PKC活化MAPK激酶MEK1和ERK114-17;野生型PKC的过度表达激活ERK1和ERK2,增加EIK1的转录活性;参与受体信号复合物到NFB转录因子的活化18, 19和P 70S6激酶信号及级联反应20, 21等。PKC/在一些恶性肿瘤如非小细胞肺癌和卵巢癌中异常表达,持续过度表达可导致细胞极性、粘附作用丧失,与肿瘤的转移、发展、预后有一定的关系22, 23。而PKM只含有催化区,是一个截短型的aPKC分子24,一旦产生,就始终处于激活状态。研究表明,PKM在长期记忆的维持和海马长时程增强中发挥了重要作用,是一个必不可少的分子25。本实验旨在研究Kibra
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