半薄超薄切片技术.ppt
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1、半薄/超薄切片技术,背景:,半薄切片,超薄切片,?,一、超薄切片技术介绍,固定地好 渗透包埋地好 切地好 载网膜做地好 染地好,超薄切片的基本要求:,超薄切片主要步骤,取材 固定 漂洗、脱水 渗透、包埋 超薄切片 超薄切片染色,每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败,1 取材,1.1 取材的基本要求 (1)动作迅速,取材后快速放入固定液中; (2)体积要小,一般13,如果来不及,例如野外取材,也可将组织修成(112)mm大小长条形,之后再进行分割。 (3)减小损伤,切割器械锋利,操作轻,避免牵拉、挫伤与挤压组织。 (4)低温操作,最好在低温(04)下进行,降低酶的活性。所用器具和固定
2、液都应预冷。 (5)取材部位要准确。,1.2 取材方法 材料放在洁净的韧性较大的纸上 滴上预冷的固定液 用刀片将组织切下并修小 用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。 植物材料的取材可以先切成薄片,经适当固定后再切成小方块继续固定。,2 固定 (抽气),2.1 固定的目的 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。 目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态,牢固地固定在它们原来所在的位置上,不发生位移。 良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。,2.2 常用固定剂,(1)四氧化锇 (OsO4)- OSMIUM TETRAOXIDE 强氧化剂,与氮原子有
3、较强的亲和力,可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白; 固定变性DNA及核蛋白,不能固定天然DNA、RNA及糖原; 具有固定和电子染色双重作用,样品图象反差较好; 酶的钝化剂,不适合细胞化学的固定; 与乙醇/醛类反应生产沉淀漂洗 分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25; 固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难; 锇酸固定液常用浓度:12; 极易挥发,对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!,(2)戊二醛 ( C5H8O2)-glutaraldehyde 有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好; 渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、内质网和细胞
4、基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等; 保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究; 对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强,均匀固定深度:0.51mm ,04可长时间固定(几周甚至12个月)不会使组织变脆,可用于远离实验室的取材; 缺点:不能保存脂肪,磷脂固定效果差,对细胞膜的显示较差,没有电子染色作用。,(3)甲醛-Formaldehyde 渗透组织的能力比戊二醛强,对于致密组织(种子)固定作用好; 细胞精细结构保存质量不如戊二醛,但酶活性的保存优于戊二醛; 缺点:不能较好的固定细胞基质,脱水后大部分细胞基质将丢失; 常用多聚甲醛戊二醛的混合固定液。,(4)高锰酸钾 强氧化剂,较好固定脂蛋白
5、; 对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结构的研究均可作为固定剂; 只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品,且一般不需要用锇酸后固定.,3漂洗、脱水,3.1漂洗 漂洗的目的: 组织固定后脱水前的漂洗: 清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间的反应,避免沉淀物干扰超微结构的观察. 双重固定中,在锇酸固定前的漂洗: 避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀,破坏细胞结构.,3.2 脱水 目的 将组织内的游离水彻底清除,保证包埋介质完全渗入组织内部。 方法 用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。,注意事项 脱水梯度逐级进行, 急剧脱水会引起细胞收缩。( 30% 50
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