紫外分光光度法测定蛋白质含量.doc
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1、 紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理; 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术; 掌握UV-1700紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。二、实验原理 紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm750nm波长范围内的吸收光谱,是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果,其吸收光谱为分子光谱,是带光谱。进行定性:利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。即将未知纯化合物的吸收光谱特征,如吸收峰的数目、位置、相
2、对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。 定量分析: 紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律:A=lgI0/I=bc,当入射光波长及光程b一定时,在一定浓度范围内,有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比,即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。因此,通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度,就可求出溶液中物质浓度和含量。由于最大吸收波长max处的摩尔吸收系数最大,通常都是测量max的吸光度,以获得最大灵敏度。光度分析时,分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b的两个吸收池中,让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液,以通过空白溶液的透光强度为I0,通过
3、待测溶液的透光强度为I,根据上式,由仪器直接给出I0与I之比的对数值即吸光度。紫外-可见分光光度计:紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计,它的主要部件有五个部分组成,即由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光,该单色光通过样品池静样品溶液吸收后,通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流,产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。 本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,因此,蛋白质具有吸收紫外光的性质,其最大吸收峰位于280nm附近(不同
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