国家高技术研究发展计划(863计划)专题课题申请书-基因操作和蛋白质工程技术专题.doc
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1、 课题类型:1.探索导向类 申请受理编号: 2.目标导向类 国家高技术研究发展计划(863计划)专题课题申请书 技术领域名称:生物和医药技术领域 专题名称:基因操作和蛋白质工程技术专题申请指南技术方向:小RNA(small RNA)关键技术课题名称:抗乙型肝炎病毒siRNA肝特异性给药载体 中华人民共和国科学技术部二六 年 九 月 十五 日填 写 说 明一、请严格按照表中要求填写各项。二、专题课题申请人可以是自然人或法人。若自然人申请课题,需有课题依托单位,申请人为该自然人;若法人申请课题,法人是当然的依托单位,封面中的申请人应填写法人名称,申请负责人由法人指定。每个课题申请只能有一个申请人和
2、一个课题依托单位。三、申请书中第一次出现外文名词时,要写清全称和缩写,再出现同一词时可以使用缩写。四、组织机构代码是指课题承担单位组织机构代码证上的标识代码,它是由全国组织机构代码管理中心所赋予的唯一法人标识代码。五、附件中相关材料需要以电子文档方式上传,具体要求详见国家科技计划项目申报中心网站中的863计划申报用户手册。 六、审核意见和声明中需填写课题依托单位/协作单位负责人姓名和申请人姓名,单位管理员提交国家科技计划项目申报中心后,即视为审核意见和声明有效,申请人和课题单位负责人需对申请书内容的真实性和有效性负责。一、基本信息课题名称抗乙型肝炎病毒siRNA肝特异性给药载体行业领域人口与健
3、康预计完成年限3.0年课题密级公开级预期成果类型论文、实物、专利申请(负责)人信息依托单位信息协作单位信息单位名称单位性质组织机构代码课题经费来源(万元)总经费100申请863计划资助100其它国家级资助(包括部门匹配)地方政府匹配银行贷款自有资金其它资金经费备注所在单位 课题参加总人数 8 。 其中:高级职称 3 人, 中级职称 1 人, 初级职称 4 人, 无职称 0 人; 其中具有:博士学位 3 人, 硕士学位 0 人, 学士学位 5 人, 其它 0 人; 合计:投入 168 人月。二、课题组主要研究人员情况在课题中分担的任务课题组中职务(组长、副组长或成员)为本课题工作时间(人月)专
4、业职务职称出生日期性别姓 名序号123456789102.1课题组长、副组长资历情况课题组长-童贻刚-资历情况:学历:1997.8-2000.7 军事医学科学院医学微生物学专业,获理学博士学位。1988.8-1991.7 军事医学科学院医学遗传学专业,获医学硕士学位。1984.9-1988.7 复旦大学生物工程系遗传和遗传工程专业,获理学学士学位。工作经历:2001.9-至今 军事医学科学院微生物流行病研究所,副研究员2003.4-2005.4 加拿大不列颠哥伦比亚大学(UBC),博士后主要从事传染病的分子生物学和抗体工程的研究工作,两次获得军队科技进步二等奖(分别为第二2001-2-101-
5、2、第三贡献人96-2-7-3),在加拿大留学期间获得Micheal Smith奖(http:/msfhr.org/)。完成863课题一项No.1502201,“抗人整合素v3人源化抗体的研制”,2002-2004;北京市自然科学基金课题一项No.5022012,“人源抗-Tie2完整抗体在CHO细胞中的表达”,2002-2004;总后“八五”计划青年基金一项,“丙型肝炎病毒中国株基因组核苷酸序列分析及其与国外株的比较”, 1991-1993。国外发表论文9篇,国内发表论文40余篇。近几年来,本人在加拿大做过一些siRNA方面的研究工作,具体做法是用siRNA技术敲除gamma-secrata
6、se的亚基APH-1、PEN-2和Nicastrin。2005年回国以后即开展肝细胞特异性基因治疗载体的研究工作,已经完成一些基础性的构建工作,如已经构建成功用于缺陷HBV的包装质粒,并以此构建了假病毒包装细胞系;已经构建病毒基因全部剔除的缺陷HBV载体,并且已经将绿色荧光蛋白基因插入其中,目前正在进行假病毒的分泌试验,相关工作正在申请专利。代表作品:1. Sun X, Tong Y, Qing, H. Chen C-H, and Song W (In Press). Increased BACE1 Maturation contributes to Alzheimers Disease pa
7、thogenesis in Down Syndrome. The FASEB Journal 20(9):1361-8. 2. Li Y, Zhou W, Tong Y, He G, and Song W (2006). Control of APP Processing and A Generation Level by BACE1 Enzymatic Activity and Transcription. The FASEB Journal 20(2):285-92. 3. Tong Y, Zhou W, Fung V, Christensen MA, Qing H, Sun X, and
8、 Song W (2005). Oxidative stress potentiates BACE1 gene expression and Ab Generation. Journal of Neural Transmission 112(3):455-69.4. Sun X, Wang Y, Qing H, Christensen MA, Liu Y, Zhou W, Tong Y, Xiao C, Huang Y, Zhang S, Liu X, and Song W. (2005) Distinct Transcriptional Regulation and Function of
9、The Human BACE2 and BACE1 Genes. The FASEB Journal 19(7):739-749.5. Qing H, Zhou W, Christensen MA, Sun X, Tong Y, and Song W. (2004) Degradation of BACE by the Ubiquitin-Proteasome Pathway. The FASEB Journal 18(13):1571-3.6. Zhou W, Qing H, Tong Y, and Song W. (2004) BACE1 Gene Expression and Prote
10、in Degradation. Annals of the New York Academy of Sciences 1035:49-677. Hou, L., Du, G., Guan, R., Tong Y. and Wang, H. (2003). In vitro assay for HCV serine proteinase expressed in insect cells. World J Gastroenterol 9(7):1629-32. (PMID: 12854181)8. Du, G., Hou, L., Tong Y. and Wang, H. (2002). Est
11、ablishment of a simple assay in vitro for hepatitis C virus NS3 serine protease based on recombinant substrate and single-chain protease. World J Gastroenterol. 8(6):1088-93. (PMID: 12439931) 9. Hou, L., Du, G., Tong Y. and Wang, H. (2002). Identification of B cell epitopes of hepatitis C virus RNA
12、dependent RNA polymerase. J Virol Methods 104(1):1-8. (PMID: 12020787)10. Mi Zhibao, Feng Fumin, Zhang Xitan, Lian Zhenhua, Wang Hongli Tong Yigang. The signficance of HBV preS1 peptide and anti-preS1 antibody in HBV infection. Chinese Medical Journal. 1999;112(4)321-2411. Mi Zhibao, Guo Jutao, Feng
13、 Fumin, Chen Wen, Zhang Xitan, Tong Yigang. Expression of HBV preS1 peptide in E.coli and product characterization. Chinese Medical Sciences Journal 1997;12:37-4112. 李建民,陈薇,贾秀杰,安小平,李冰,樊英茹,童贻刚. 用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究. 细胞与分子免疫学杂志, 2005,03:52-55+58.13. 廖振林,侯利华,李建民,陈薇,王臣,王慧春,安小平,童贻刚. 半合成抗体库的构建及抗Tie2
14、 Fab抗体的筛选. 微生物学通报, 2004,06:40-44. 14. 吕永强,杜桂鑫,童贻刚. 应用随机PCR技术制备靶基因文库随机片段. 第三军医大学学报, 2004,20:88-90. 15. 李建民,陈薇,安小平,李冰,樊英茹,郝晓萌,左少军,童贻刚. 基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究. 中华微生物学和免疫学杂志, 2004,10:31-35. 16. 吕永强,杜桂鑫,廖振林,罗保君,童贻刚. 人血管生成素-1基因的克隆及表达载体的构建. 武警医学院学报, 2004,05:37-39. 17. 廖振林,侯利华,陈薇,童贻刚. Tie2受体研究进展及其在抗肿瘤治
15、疗中的应用. 生物技术通讯, 2004,04:69-71. 18. 李建民,陈薇,安小平,樊英茹,郝晓萌,李冰,陈万荣,刘树玲,童贻刚. 抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达. 军事医学科学院院刊, 2004,03:27-30. 19. 王臣,侯利华,张彦明,李建民,廖振林,杜桂鑫,陈薇,童贻刚. 抗人整合素_3 单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建和表达. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2004,05:12-16.20. 王臣,侯利华,张彦明,李建民,廖振林,杜桂鑫,陈薇,孙启鸿,童贻刚. 抗人整合素_3单链抗体的构建和表达. 细胞与分子免疫学杂志, 2004,
16、02:36-39.21. 吕永强,廖振林,童贻刚. 人血管生成素-1原核表达载体的构建与表达. 临床军医杂志, 2003,03:6-8. 22. 童贻刚,王海涛,徐静,付玲,于长明,刘国奇. 人源抗-HBsAg-干扰素融合蛋白在CHO细胞中的表达. 中华肝脏病杂志, 2001,02:114-116.23. 童贻刚,徐静,刘国奇,张永国,陈万荣,刘树玲,王海涛。人免疫球蛋白IgG1亚型Fc基因的克隆以及人抗-HBsAg全分子抗体在哺乳细胞中的表达。生物化学与生物物理学报2000;32(4):392-9624. 童贻刚,王海涛,徐静,付玲,于长明,刘国奇。人源抗-HBsAg-干扰素融合蛋白在CHO
17、细胞中的表达。中华肝脏病杂志 2001;9(2):115-1725. 童贻刚,杜勇,徐静,李敬云,鲁晏希,鲍作义,王海涛。HIV p24蛋白在大肠杆菌中的高效表达、一步纯化及抗原性分析。中国病毒学杂志,2000;15(2):116-2126. 童贻刚,王海涛,陈万荣. 中国人-神经生长因子前体基因的克隆及其序列分析。中国应用生理学杂志1997;13(4):316-1827. 童贻刚,黄耀煊,邬广惠. HBV X基因在大肠杆菌中高效表达及血清抗X抗体的检测。生物工程学报1993;9(3):252-5528. 童贻刚,李谐勋,李育阳,高卜渝. A干扰素基因在酿酒酵母中的表达。复旦学报:自科版.19
18、90;29(4):368-3732.2课题组长、副组长目前承担863计划和其它国家科技计划课题情况(包括人员姓名、承担课题名称、课题经费数、课题起止时间、所属科技计划名称等信息)姓名承担课题名称课题经费数(万元)课题开始时间课题结束时间所属科技计划其他说明事项:课题组长去年从国外留学回国,尚未承担其它国家计划课题。2.3课题组长及课题组主要成员是否曾就相同或类似课题向863计划和国家其它科技计划提出申请(如有,请说明申请人姓名、申请科技计划名称、申请课题名称、申请时间、申请结果等情况,并说明与本课题申请的关系)否三、课题情况3.1课题简介目的意义:慢性乙型肝炎是严重影响我国人民身体健康的一种疾
19、病,尽管干扰素和核苷类似物对该病有一定的疗效,但仍然存在很多的问题,如治疗效果不好,停药后反弹,易产生耐药突变,价格昂贵等,因此新的治疗方案亟待开发。RNA干扰是近年来发展起来的一项新的技术,具有非常诱人的应用前景,已经有多个相关的产品进入临床试验。由于乙型肝炎病毒基因组非常紧凑,绝大部分区域存在基因重叠,因此其突变将受到很大的限制,这一特点使它尤其适合于基于核苷酸序列的治疗方案,而这类方案中,小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)最具潜力。主要研究内容:本项目将研制一种新型的肝细胞特异性的siRNA给药系统,该系统由乙型肝炎病毒(hepatitis B v
20、irus, HBV)基因组改造而来,经定点突变破坏HBV的所有的开放阅读框(open reading frame, ORF),使之不表达任何病毒蛋白质,但是可以被患者肝细胞中的野生型病毒提供的蛋白质复制和包装,产生假病毒颗粒,该假病毒颗粒可以分泌到细胞外,进而感染其他的肝细胞。由于该假病毒载体上克隆了短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)基因(在细胞内经过转录和加工即可变成siRNA),该基因的表达可以抑制野生型病毒蛋白质的表达,发挥抗病毒作用。这样,在患者的肝细胞中,野生型病毒帮助假病毒载体复制,而假病毒载体携带的shRNA反过来抑制野生型病毒的蛋白质表达和基因组复
21、制,二者将形成负反馈平衡,并且长期稳定,直至野生型病毒被机体的免疫系统清除,假病毒也将随之消失。该siRNA给药系统将具有以下几个特点:1、除了患者已经有的病毒蛋白成分之外,不携带任何其他的抗原成份,不会激发机体的免疫,安全性更好;2、可以被野生型病毒复制,因此具有放大作用,使用很小的剂量即可充分发挥其效果;3、假病毒载体以负反馈方式稳定地平衡并抑制野生型病毒的表达与复制,可以产生良好的抗病毒效果,并且可以长期发挥作用(无需多次用药),直至野生型病毒被机体免疫系统清除。预期目标:1、 建立安全、不会产生野生型病毒的假病毒包装细胞系。2、 构建分泌能力强、且能有效表达外源基因的假病毒载体。3、
22、设计合成并筛选到具有抗-HBV作用的shRNA。4、 获得表达绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)和抗-HBV shRNA的假病毒颗粒。5、 假病毒具有良好的感染原代培养人肝细胞的能力。6、 假病毒在鼠移植人肝细胞模型中具有良好的超感染能力。3.2课题主要研究技术的国内外发展现状与趋势,课题主要研究技术国内外专利授权情况国内外发展现状与趋势:RNA干扰是近年来发展起来的一项新的技术,具有非常诱人的应用前景,已经有多个相关的产品进入临床试验(用于预防与治疗丙肝病毒、艾滋病毒、呼吸道合胞病毒感染和老年视网膜黄斑变性、哮喘,Hunting
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