吸收光检测原理及应用.doc
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1、吸收光检测原理及应用1.检测原理a)布格-朗伯-比尔定律,是光吸收的基本定律,适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质,包括气体、固体、液体、分子、原子和离子。比尔-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础。b)朗伯-比尔定律: OD = C b 光吸收值(OD)与浓度成正比c)比尔朗伯定律数学表达式: A=lg(1/T)=KbcA为吸光度,T为透射比,是透射光强度比上入射光强度 K为摩尔吸收系数.它与吸收物质的性质及入射光的波长有关. c为吸光物质的浓度 b为吸收层厚度d)物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比
2、。2.吸收光的应用a)生物大分子定量:基于260nm、280吸收光检测-核酸定量i. 核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的性质。最佳测量值的范围为 0.1 至 1.0。每种核酸的分子构成不一, 因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如: 1OD 的吸光值分别相当于 50g / mL 的dsDNA, 37g / mL 的 ssDNA, 40g/mL 的 RNA, 30g/mL 的寡核苷酸。ii. A280nm 是蛋白和酚类物质最高吸收
3、峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8,纯 RNA 为 2.0。假如比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要纯化样品。iii. A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯 DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值为2.5。若比值小于 2.0 表明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。iv.A320nm 或 A340nm 为检测溶液样品的浊度,该值应该接近 0.0。假如不是,标明溶液中有悬浮物,需要纯化样品。v.核酸的吸光值受 pH 值和缓冲液离子浓度影响。只有在一
4、定的 pH 值和低离子浓度的条件下(如 10 mM Tris-HCl pH8.0),才能得到精确的检测结果。b)生物大分子定量:基于260nm、280吸收光检测-蛋白定量i. 蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,所以蛋白质溶液在275280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内,蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比,服从朗伯-比耳定律,因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.11.0mg/mL。ii. 由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同,所处的微环境也不同,所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收值也不同。据初步统计,浓度为1.0 mg/mL的1800
5、种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.33.0之间,平均值为1.250.51。所以此种方法测量的准确度差一点。iii. 若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质,在280nm处来测量蛋白质含量时,会有较大的干扰。核酸在260nm处的光吸收比280nm更强,但蛋白质却恰恰相反,因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。iv. 常用下列经验公式计算: 蛋白质浓度(mg/mL)=1.45A280-0.74A260 ; (A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)v. 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量:蛋白质浓度(m
6、g/mL)=F* A280*D*1/d;其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值;d为石英比色皿的厚度(cm);D为溶液的稀释倍数;F为校正因子c)酶联免疫吸附实验-ELISA-疾病因子,动物疫病,食品安全i. 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。ii. 在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的
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