3微生物检验技术.ppt
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1、食品微生物学 检验技术 刘晓庆 宾 态 恬 火 恰 豪 蜀 疫 陇 傍 桩 忧 症 纳 悲 刘 孙 块 灯 诣 歼 雌 您 纵 囤 炸 孺 眶 敖 躲 抉 腥 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 1 微生物试验方法 取样 培养基制备 灭菌和消毒 无菌操作 培养、计数 饮料微生物检测方法 国标:菌落总数、霉 菌和酵母菌、大肠菌 群、致病菌 企标要求 常见问题处理 坡 绅 陋 钮 豆 煽 蚕 浴 鳖 荷 该 畸 列 晤 拱 浪 燕 旬 辑 抚 搀 月 处 蜒 腊 室 桥 复 赤 窥 戒 小 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 2 取样 准备工
2、作 取样工具:消毒,灭菌 样品存放容器:清洁、干燥 取样标签 取样注意问题 采样均匀 避免污染 标记准确、牢固 及时保存 若不及时检测应保存在4冰箱,最长不超 过24h。 漫 赫 厉 写 狸 儒 质 磊 郁 墟 踪 部 姥 仍 旗 杖 茸 证 遣 熙 法 搜 甸 斌 燃 额 谷 绢 怔 鄂 己 少 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 3 培养基制备 玻璃器皿的清洗 新购的玻璃器皿 将器皿放入盐酸溶液中浸泡数小时,以除去游离 的碱性物质,最后用流水冲净。 常用旧玻璃器皿的洗涤 确实无病原菌或未被带菌物污染的器皿,使用前后, 可按常规用洗涤剂进行刷洗; 带菌玻璃器皿的洗
3、涤 凡实验室用过的菌种以及带有活菌的各种玻璃器皿, 必须经过高温灭菌或消毒后才能进行刷洗。 赡 袁 御 饲 酋 纯 坏 伞 议 菜 嚷 辑 玩 涸 腆 乃 箕 锦 腥 铲 思 倾 象 村 袄 腥 丈 盎 碴 刊 石 算 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 4 培养基制备 为满足微生物生长和代谢的需要,培养基必须包含 碳源、氮源、水、无机盐、能源和生长因子六大类 营养 物质。 购买:选择质量好的培养基,注意保质期,记录收 货期。 贮存:30以下,避光保存于阴凉干燥处,使用 后,拧紧瓶盖,避免吸潮、氧化或污染。 保质期:一般未开封的培养基可保质年,已开封 的可保质半年。
4、建议在瓶体注明开封日期。对于个 别极 易变质的品种,建议冷藏保存,可延长保质期。 冶 媚 疏 缩 炔 纠 瞒 移 史 困 皿 宜 论 草 凸 吐 蝉 镍 铺 演 麻 郧 彬 捅 玄 华 绘 凝 迹 鹰 胎 读 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 5 培养基制备 培养基分类 根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区 分: 天然培养基 是利用各种动、植物或微生物的原料,成分难以 确切知道。主要原料有:牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、 玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。这种培养 基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。 合成培养基 是用已知化学成分的化学
5、药品配制而成。化学成 分精确、重复性强,但价格昂贵,而微生物又生长缓慢,所以 它只适用于做一些科学研究,例如营养、代谢的研究。 半合成培养基 在合成培养基中,加入某种或几种天然成分; 或者在天然培养基中,加入一种或几种已知成分的化学药品即 成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生 产实践和实验室中使用最多。 窟 被 溢 匪 态 慰 污 今 仍 拍 博 抿 爪 眩 宾 灰 球 棘 绎 液 得 孙 枢 纳 烈 努 染 山 栋 豁 园 理 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 6 培养基制备 培养基分类 根据培养基的物理状态来区分: 液体培养基 所配制的培养基
6、是液态的,其中的成分基本上溶 于水,没有明显的固形物,液体培养基营养成分分布均匀, 易于控制微生物的生长代谢状态。 固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养 基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等,以琼脂最 为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。 半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中,就 制成了半固体培养基。以琼脂为例,它的用量在0.2-1%之间 。这种培养基有时可用来观察微生物的动力,有时用来保藏 菌种。 庸 涡 赎 均 慌 踪 逃 坊 刺 椭 向 坤 陆 诚 诊 沾 秒 庙 菲 斜 染 覆 造 蛛 浩 讽 轻 尧 忆 裁 梭 笆 3 微 生 物 检 验 技
7、 术 3 微 生 物 检 验 技 术 7 培养基分类 根据培养基的用途来区分: 选择培养基:在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的 菌种生长的培养基。如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生 长;而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长;结晶 紫能抑制革兰氏阳性细菌的生长等。 增殖培养基:常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上讲 ,增殖培养基也是一种选择培养基。 培养基制备 逊 王 级 半 烁 光 窟 妇 魄 茄 刊 院 耿 轴 钮 军 蒸 灼 遮 荡 逆 撩 躇 韵 贮 合 砌 玲 剿 思 壕 馆 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 8 培养基分类 根据培养
8、基的用途来区分: 鉴别培养基:在培养基中加入某种试剂或化学药品,使难以区 分的微生物经培养后呈现出明显差别,因而有助于快速鉴别某 种微生物。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的 伊红美蓝培养基。 有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用 的麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具 有抑制肠道菌以外的细菌的作用(选择性),乳糖和中性红( 指示剂)能帮助区别乳糖发酵肠道菌(如大肠杆菌)和不能发 酵乳糖的肠道致病菌(如沙门氏菌和志贺氏菌)。 培养基制备 码 调 材 炽 烧 滞 实 缔 郊 褂 尸 褥 仗 滞 剿 缅 奸 同 丧 腕 纪 罚 棠 据 瞧 逼 赏 侠 读
9、 字 磊 静 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 9 培养基制备 影响因素 洗涤剂中含有表面活性剂,会影响微生物生长,注意 冲洗干净。 一般不采用自来水配制培养基,因为自来水相对杂质 较多,有些含有较多的Ca2+、Mg2+离子,可与蛋白胨、 肉浸汁中的磷酸盐生成磷酸钙、磷酸镁,一旦高压灭 菌后,就会析出沉淀,从而影响到培养基的透明度, 不利于微生物的培养与观察。 蒸馏水或纯净水中所含的杂质较少,所制成的培养基 透明度高,有利于观察。 精 愧 珐 囊 烹 膳 曰 彼 戎 鉴 草 预 稳 踩 锑 叙 淫 梗 邓 袭 逼 缓 派 囊 洱 催 氮 佩 该 归 蔼 旭 3 微
10、 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 10 培养基制备 制备: 准确称取各组分,一次完成,不要中断; 混合后,煮沸或者热水溶化,充分溶解; 分装,装量300,则可估读数 壁 若 疤 下 誊 葵 哺 赁 碟 傍 菌 贰 秘 骑 曾 密 撮 蹿 杰 挡 若 上 宜 故 告 处 馋 俯 镭 可 欲 码 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 22 饮料微生物检测方法 膜过滤法 标准平板计数法 棉拭法 显微直接计数法 食品卫生微生物检验国标 嗜酸耐热菌检测 致病菌检测 企标要求 剁 壹 碉 佳 蓄 纪 笺 丹 浆 劝 讶 撇 牛 风 广 晦 琉 将 曲 寂
11、霖 悍 晴 香 撩 抽 郊 宙 愤 瞳 稍 华 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 23 膜过滤法 使用范围: 可以过滤的样品 样品含菌量相对较少,一般300cfu/ml 优点:可富集微生物,更灵敏。 过滤设备消毒灭菌:121,15min 一次性无菌滤膜(直径47mm) 0.45m:细菌总数和大肠杆菌 0.8m: 霉菌和酵母 呸 碧 兢 疗 卸 头 独 请 瓜 简 纫 集 淤 狰 赋 昔 集 贴 叹 角 蔗 肢 棋 起 锄 耶 骨 漫 襟 情 葱 汾 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 24 膜过滤法 抽滤系统 真空泵缓冲瓶集液瓶三联(六
12、联)抽滤器 抽滤 液体抽完后,空抽时间不超过30秒 可用20ml水冲洗,不可用洗瓶冲。 培养 在吸收垫上培养 在琼脂平板上 计数 直接显微计数 培养后计数 蔑 浴 绒 厨 遏 狰 浅 钳 报 腋 节 述 虽 丘 驼 既 美 慑 兄 谷 银 桌 掠 蜡 蝗 停 竖 候 发 减 卜 纲 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 25 标准平板计数法 适用范围: 难过滤的样品,滤过体积2ml,如含果肉的果汁和果汁饮料 空白对照 每一系列的测试至少需1个对照 培养基准备 在沸水中融化,置472 水浴中 步骤 在无菌培养皿中加1ml样品 在培养皿中倒入15-20ml培养基,注意:瓶
13、口不要触及皿盖 小心混匀样品和培养基 水平放置凝固后,倒置培养 计数 且 练 乞 教 讶 咳 山 廉 皇 凭 谢 斡 查 烹 估 据 湍 矽 巢 侨 澈 贩 岂 刽 票 熔 唆 辖 析 峨 秸 寡 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 26 显微直接计数法 无需培养,最快的分析方法 用于糖的微生物评估 计数结果偏高 不分死活细胞,均被计数 食品颗粒与细胞不易区分 步骤 确定膜过滤面积和视野面积 样品溶液准备 过滤样品 染色 镜检计数 叉 斯 判 搏 熏 乖 匆 执 呸 功 玩 诛 翘 恫 办 骋 边 讹 饵 涧 滴 握 识 父 整 亨 桨 暇 像 狮 津 触 3 微
14、生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 27 棉 拭 法 无法使用平板接触法的表面 柔软、不平整、不规则的表面 材料 无菌棉签 无菌水不平整 步骤 选择采样点,并作记录 在试管上作相应的记录 取出无菌棉签,在无菌水中浸湿 在待检表面擦拭,并注意擦拭孔缝 擦拭完毕放回无菌管中,盖好塞子 采用膜过滤法或平板法分析,在一 小时内完成。 便 纳 江 敝 及 辗 制 纺 壶 氦 湃 敷 玉 本 己 凸 夸 批 涕 屿 蔗 景 褂 脚 嘶 星 颧 馁 能 畔 冲 工 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 28 快速微生物检测法 ATP分析系统 ATP生物荧光检测计
15、数法 直接荧光膜技术 拎 腋 叶 饰 彼 瘩 玻 闪 霓 嗓 量 删 各 哩 盖 坛 量 驼 霜 潘 衫 堪 州 盼 撞 浊 车 仟 痹 冰 现 痕 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 29 关于饮料的检验 GB/T4789.21-2003 冷冻饮品、饮料检验 采样:果蔬汁饮料、碳酸饮料、茶饮料和固体饮料:应采取原 瓶、袋和盒装样品。样品采取后应立即送检,如不能立即检验 ,应置冰箱保存。 处理:对于瓶装饮料,用点燃的酒精棉球烧灼瓶口灭菌,用石 碳酸纱布盖好;塑料瓶口可用75%酒精棉球擦拭灭菌,用灭菌 开瓶器将盖启开;含有二氧化碳的饮料可倒入另一灭菌容器内 ,口勿盖紧
16、,覆盖一灭菌纱布,轻轻振荡,待气体全部逸出后 ,进行检验。 检测:菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡 萄球菌、霉菌和酵母计数,均按照GB/T 4789 执行;乳酸菌检 验按照GB/T16347执行。 旭 绸 吏 性 狼 氢 勒 要 服 郸 蛛 猖 膨 荡 谈 抠 燥 叁 蚌 振 驮 欢 之 储 密 暮 晋 耽 溪 加 呜 寻 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 30 食品卫生微生物检验国标 GB 4789-2010 菌落总数测定 霉菌和酵母菌计数 大肠菌群计数 宗 牡 缩 狠 清 务 橡 叙 侍 窖 枝 抹 液 寓 羌 了 倾 绢 丁 誉 痹 歇 宰
17、烧 于 操 锦 御 等 饺 椎 步 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 31 菌落总数测定 GB 4789.2-2010 磷酸盐缓冲液 或生理盐水 吸管尖端不要触及瓶口或试 管口外部,也不得触及管内稀 释液。 吸管插入检样液内取样稀释 时,插入深度要达2.5cm以上, 调整时应使管尖与容器内壁紧 贴。 进行稀释时,应使吸管内的 液体沿管壁小心流加入,以免 增加检液。 每递增稀释一次,即换用一 支1ml灭菌吸管。 混匀时可先顺时针 旋转,再逆时针旋 转,旋转中应防止 混合物溅到平皿壁 和皿盖上。 检样过程中应用稀释液做空 白对照,用以判定稀释液、培 养基、平皿和吸管是
18、否被污染 。 检样过程中应在工作台内打 开一块空白PCA(其暴露时间 应与检样时间相当),以了解 样品在检验操作过程中有无受 到来自环境的污染。 检样从开始稀释到倾注最后 一个平皿,所用时间不宜超过 20min。 如果把不能立即计数,要将 平板放入04冰箱中,但 不能超过24 h。 豢 户 隆 诉 强 氯 呵 芳 陕 谍 癸 脆 焉 绥 侍 绊 眯 凶 贾 丑 掌 啊 了 隋 攻 羡 厂 菜 岗 工 鉴 艾 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 32 菌落总数计数方法 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算 两个平板菌落数的平均值。 若所有稀释度的平板上
19、菌落数均大于300CFU,则对稀释度最 高的平板进行计数。 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则对稀释度最低 的平均菌落数进行计数。 若所有稀释度平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释 倍数计算。 胎 瘤 捞 译 恤 弃 滨 啦 毯 酵 尾 渠 灵 眩 甚 胯 赚 贷 绣 琐 靶 乓 严 婴 超 狞 止 乱 律 罗 阮 而 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 33 菌落总数计数方法 若所有稀释度的平板菌落数均不在30-300CFU之间,则以最接 近30或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 当有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围之内时,计 算公
20、式为: N样品中菌落数; C平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和; N1第一稀释度(低稀释倍数)平板个数; N2第二稀释度(高稀释倍数)平板个数; d稀释因子(第一稀释度)。 碾 瞩 鲜 魁 侨 赂 搔 耳 屿 昭 酒 箱 守 呐 海 徊 桔 哎 琵 狠 陀 空 系 忧 貉 晤 虞 偏 案 共 政 陶 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 34 霉菌和酵母菌计数 GB 4789.15-2010 稀释液为 无菌水 嫁 甄 勤 爪 汗 差 蝎 鼓 旺 内 逝 躺 谅 锯 渐 啤 旷 碎 霹 帝 蹭 绢 胺 瑟 抉 幻 榔 瞒 障 挤 菇 偷 3 微 生 物 检 验 技
21、 术 3 微 生 物 检 验 技 术 35 霉菌和酵母菌的计数 选取菌落数在10-150CFU的平板进行计数。计算两个平板 菌落数的平均值,再乘以相应稀释倍数计算。 若所有平板上菌落数均大于150CFU,则对稀释度最高的平 板进行计数。 若所有平板上菌落数均小于10CFU,则对稀释度最低的平 板计数。 若所有稀释度平板均无生长,则以小于1乘以最低稀释倍 数计算。若为原液,则以小于1计数。 报告时以CFU/g或CFU/mL为单位分别报告霉菌和酵母菌数 。 祷 浴 鲍 栗 沤 勿 岸 运 拴 寸 禾 笺 馋 被 通 绥 酗 姥 剪 景 丑 蛔 鱼 酬 缄 灭 狱 秽 撞 窄 箔 堤 3 微 生 物
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