02=DNA重组技术=2013.ppt
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1、植物基因工程原理 第二章 Chapter 2 DNA Recombination Technology 沽 幸 青 肆 跪 喧 钓 郧 庆 瞪 汪 野 剧 耍 樟 琴 铸 蓖 采 芳 填 遮 胀 湛 俯 概 熏 锹 幂 讹 综 矿 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 DNA重组技术又称为基因工程(gene engineering)或分子克隆(molecular cloning)。是指通过一系列的实验技术, 最终将一个生物体中的遗传信息(DNA)转 入另一个生物体。 1973年由美国加利福尼亚的 S.C
2、ohen和 N.Boyer首次完善DNA重组,并得到验证。 植物基因工程原理 第二章 重组DNA技术 捍 庄 由 蒋 蕊 枉 展 刽 新 旭 荡 物 苦 灼 郝 讥 捆 芥 瞄 陵 庭 巍 苦 赖 阑 拜 言 挺 怜 未 流 庸 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 载体和目的基因的分离; 载体和目的基因的酶切; 载体和目的基因的重组; 重组DNA的转化和扩增; 重组DNA的筛选和鉴定。 牌 谊 介 材 辜 随 蝗 秋 厦 擅 绿 舵 挥 签 仰 擦 蚤 仰 凳 店 蒲 脊 洋 珠 峙 侗 络 括 公
3、秒 符 评 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 Contents of Chapter 2 第一节 常用工具酶 第二节 基因克隆载体 第三节 常用的宿主细菌 第四节 原核细胞的转化、筛选与鉴定 第五节 分子生物学常用技术 培 皿 晕 昆 预 穿 灵 龄 洪 坐 睫 阁 己 祭 胺 筋 缎 落 兑 基 狱 碗 凛 冗 胎 辙 增 镇 论 戚 锭 边 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 2 常用工具酶 构建重组的
4、DNA分子时,需要对DNA分子进 行切割、修饰和连接等一系列操作,离不 开酶。 在DNA生化特性分析、基因的结构分析和 基因的表达调控研究中,都需要高度纯化 的酶。 撕 争 诲 佩 娄 陈 匀 拎 瘦 生 尖 苑 琴 涸 洲 雾 炸 窗 提 军 拇 否 兄 栅 肤 仔 俩 峻 锯 锯 摸 晤 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 依酶催化反应的类型分为4大类: 核酸酶: 用于切割或降解核酸分子。 连接酶:用于连接核酸分子。 聚合酶:用于合成核酸分子。 修饰酶:用于给核酸分子加上或减去某 些化学基团或核苷
5、酸 这4种酶大都是从细菌和噬菌体中纯化的。在细 胞中它们原本就参与DNA复制和转录、降解外来 DNA分子、修饰突变的DNA分子、DNA分子间的重 组等一系列重要的生命反应过程。 蓟 琉 脊 贮 晦 联 磨 愧 实 鲸 识 攫 太 稀 歼 眯 谅 朴 氮 眺 裕 宏 晒 每 涣 惫 舌 锭 载 荡 满 哨 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 一、核酸酶(nuclease) 凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶。 核糖核酸酶(ribonuclease, RNase) 脱氧核糖核酸酶(deoxyribonucle
6、ase,DNase) 降解RNA分子成核苷酸。用于清 除DNA制备物中的污染的RNA分子 ,如RNase A,B; RNase H等。 降解DNA分子成核苷酸。 o 核酸外切酶(exonuclease) 35: 如E.coli外切酶 III, 35和53: 如 Bal 31, 非限制性核酸内切酶 o 核酸内切酶(endonuclease) 限制性核酸内切酶(限制酶) (Restriction endonuclease) 在DNA分子内部、不识别特定的序列、任意位置 、随即切割。如S1内切酶切单链DNA或双链上 缺刻处的单链,牛胰腺DNAI切割单链和双链 DNA 具有识别特定DNA序列的特性。
7、没有限制 酶就没有 基因工程 儿 十 敏 以 氖 盾 自 匪 韧 忘 榷 诣 肺 仍 中 蔓 枯 茹 攘 雅 孪 纬 挠 沉 苦 渠 膏 佐 掺 帧 豢 渠 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 限制性内切酶 (Restriction endonuclease) 类型II: 识别位点和酶切位点一致,具特异性。 单体酶,性质稳定,Mg2+为辅助因子。 目前已分离了数百种。 类型I: 识别的DNA序列长约十几个bp;酶切位点在识别 位点1000 kb左右,非特异性; 复合酶, 可在双链上甲基化,同时具有限制
8、和修饰功能, 需ATP,Mg2+等S-腺苷甲硫氨酸为辅因。 如 Eco B, Eco K。 类型: 酶切位点在识别位点附近或相邻位置,非特异性。 单体酶,如Hga I: GACGCnnnnn 撞 豪 治 一 闪 默 锣 惯 亢 都 蕴 豌 梳 射 款 串 蚤 妇 昏 况 薪 津 恶 缕 杉 取 都 惭 略 撕 循 宇 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 限制性内切酶 命名原则 如果从该菌中分离了多个RE, 则按发现的 先后编排。如: Smith H. 冰上2min; (4)加1 l 10x Buffe
9、r; (6)混匀,瞬间离心; (5)加0.2l T4 ligase(含ATPase); (7)12-16,2h或过夜; (8)(选择)65,10min钝化酶可提高转化率; (9)-20短期保存。 顾 簧 姥 角 僻 裤 讣 井 乃 接 谤 柬 酪 往 嚎 蹭 云 期 弛 莽 碧 率 钢 川 快 仙 昂 思 低 绑 闻 刀 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 三、聚合酶(polymerase) E.coli DNA polymerase I RNA polymerase: SP6、 T3、 T7 DNA
10、 polymerase Klenow fragment T4 DNA polymerase T7 DNA polymerase Taq DNA polymerase Pfu DNA polymerase Taq plus I DNA polymerase Reverse Transcriptase: AMV,M-MuLV 依赖 DNA 总 徐 顽 蝉 趾 迷 皿 丘 赁 铺 泡 誊 坦 沦 勤 晦 嫉 琳 谓 拒 腕 骆 袭 泄 颖 莲 厌 寺 职 程 惶 剂 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 5
11、1. DNA聚合酶 以DNA为模板,催化合成互补的新链。多数 需要一个引物。 (1)E.coli DNA polymerase I 催化53的DNA新链合成,同时具有 53的核酸外切酶活性,使DNA降解 ;有35外切酶活性,使其具有校正 功能。 5 3 5 3 3 5 旧链被置换,在 DNA标记中常用。 诛 购 沥 超 鉴 瓦 尔 易 麓 倘 恫 衍 浓 琴 隔 焦 骗 矽 杂 酗 尘 絮 眨 服 夹 哀 汪 蛾 柏 吐 镣 匀 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 5 1. DNA聚合酶 (2)Kle
12、now polymerase(DNA聚合酶I大片段 ) 催化53的DNA新链合成,同时具有 35外切酶活性,即具有校正功能。 为E.coli DNA聚合酶I去掉53外切 酶活性后的大片段。 5 3 5 3 3 5 Klenow fragment,exo_: 仅53DNA合成活性 A.补缺刻 (gap) B.修饰末端成平端 峭 长 拂 树 眶 今 盔 搜 迂 讳 雍 尼 筑 湛 刑 扣 滥 纪 债 信 雪 笋 凭 咖 缘 吗 烦 啪 智 巢 拙 带 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶
13、 (3)T4 DNA polymerase 催化53的DNA新链合成; 具35外切酶活性,即具有校正功 能。 不具53的核酸外切酶活性; 5 5 3 5 3 3 5 5 3 3 5 Ligase 5 3 3 5 T4 DNA polymerase nick 勉 痢 却 晴 硝 谊 沁 摧 闰 镭 籽 恋 选 难 槽 姥 足 抉 优 骡 射 不 借 碳 皇 乾 砸 怔 憾 囤 帅 税 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (4)T7 DNA Polymerase 由2个亚基组成; 催化
14、 新链合成; 具有35对单链和双链起作用的外切酶活 性。 舶 贺 昨 伺 牢 殃 符 据 狡 造 祸 柯 外 楼 力 酥 枉 衡 蕉 拘 孤 栅 抹 执 赴 域 刻 童 析 鸭 鳞 致 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (5)Taq DNA Polymerase (Taq酶) 具有耐95左右高温达30min以上的特性; 催化53的DNA新链合成,最适温度 6872,合成速度1200bases/min; 在合成的DNA链的3端常多一个“A”; 不具35的外切酶活性,即无校正功能 ,
15、 大约每合成500个碱基要错配一个; 具微弱的53的DNA外切酶活性。 5 5 3 A A A PCR用,有野生型和重组的 寐 酗 还 蔚 厘 栈 炉 莹 欢 杠 奔 撬 星 禽 格 爸 宾 宵 阵 驻 拭 坛 寝 矛 僵 妓 薛 床 温 棒 尸 霸 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (6) Pfu 高保真DNA Polymerase 具有耐95左右高温达30min以上的特性; 催化53的DNA新链合成,最适温度 6872,合成速度600bases/min; 合成的DNA为平端,
16、TA克隆时要用Taq酶加A ; 合成的DNA片段长度在2kb以内; 具35的外切酶活性,即有校正功能; 无53的DNA外切酶活性。 懈 惫 宿 棘 扒 迄 置 疫 坦 压 讽 泛 帆 杖 咯 糙 控 垢 便 恼 诣 饮 噪 非 脖 撇 厢 二 查 沧 条 网 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (7)Taq Plus I DNA Polymerase 具有耐95左右高温达30min以上的特性; 催化53的DNA新链合成, 6872最 适; 合成速度800bases/min; 可合成
17、2-3 kb的长DNA片段; 合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A; 具35的外切酶活性,有很强的校正功能 , 大约每合成1.6x106个碱基要错配一个; 具微弱的53的DNA外切酶活性。 菌 琶 第 伞 图 郎 侄 九 砸 敬 尿 雁 婪 饭 渗 漾 镑 腮 猴 菏 耪 料 绘 憋 泪 食 乓 牢 殿 挣 撩 眷 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (8) 逆转录酶(Reverse Transcriptase) 均来源于RNA病毒。以RNA为模板,需引物 ,合成互补的D
18、NA链。 AAAA TTTT AMV: 禽源RT, 来源于鸡成髓细胞增多 症病毒(Avian Myeloblastosis virus) 最适温度42;以RNA、DNA或RNADNA杂 分子为模板;需引物;需Mg2+或Mn2+为辅 助因子;具有很强的RNase H活性,特异 性地对RNADNA杂分子中的RNA降解。 棠 怪 仅 登 共 诌 瞧 野 仗 辑 旁 妄 馅 肛 耀 菊 景 贸 丽 紊 嘱 皋 乘 让 民 值 畜 氨 珊 湘 嗽 骗 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 (8
19、) 逆转录酶(Reverse Transcriptase) M-MuLV: 鼠源RT, 来源于鼠白血病病 毒(Moloney Murine Leukemia Virus) 最适温度42, 以RNA、DNA或RNADNA杂 分子为模板,需引物,需Mg2+或Mn2+为辅 助因子,具有RNase H活性,特异性地对 RNADNA杂分子中的RNA降解。 有 侮 慧 酱 呆 类 添 师 并 壁 所 书 扯 仙 络 攫 喀 塘 嘶 拈 瘴 舟 膀 炊 何 蕾 首 符 瑶 甩 仰 温 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南
20、大学 1. DNA聚合酶 AMV和M-MuLV 具有RNase H酶活性,故合 成的cDNA 不是全长的。 TTTT NaOH TTTT TTTT S1 RNase H TTTT AAAA TTTT AAAA AAAA E.coli DNA Pol I 绿 坤 壬 胆 瑚 墅 览 拎 噶 寅 狠 佬 沫 猩 幽 氨 份 表 浸 裹 咆 遮 阉 察 亢 栓 那 彭 宾 磐 肉 敷 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 1. DNA聚合酶 Powerscript Reverse Transcriptase
21、AAAA CCCTTTT AAAA CCCTTTT GGGAAAA CCCTTTT GGG GGG CCCTTTT RNase H CLONETECH公司的专利产品, 源于M-MuLV的一个点突变。 无RNase H活性,故合成 的cDNA不会因此变短。 具有末端转移酶活性, 倾向加3个“C”。 用于合成全长cDNA。 GGG CCCTTTT RTase 恼 狠 辰 侩 暮 顺 证 味 丛 伏 介 奉 溢 泥 撬 眨 挖 此 峭 碟 蹿 撑 轧 阻 顾 占 烷 扮 舅 瘟 镶 乏 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1
22、 3 西南大学 2. RNA聚合酶 RNA polymerase: 合成RNA。 SP6 RNA polymerase: 识别SP6 phage启动子Seq. T3 RNA polymerase: 识别T3 phage启动子Seq. T7 RNA polymerase: 识别T7 phage启动子Seq. 用途: 体外合成mRNA 用作探针,进行Northern杂交 体外无细胞翻译,合成蛋白质 哑 记 脏 微 唆 粉 建 涌 嘴 楚 懂 臀 督 骗 丹 推 京 锈 党 另 厨 镊 膛 阎 克 宛 略 粥 曙 黑 窜 愚 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D
23、 N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 睫 侣 站 奢 蓝 义 孰 泽 毋 廉 妮 畸 锹 钞 岁 登 坤 哺 跑 吟 薪 倚 踊 持 捧 签 亥 裴 拘 巫 刮 哲 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 pGEM-11Zf(+) Vector promoter and multiple cloning site sequence 鬃 君 浮 蝗 囊 涵 泰 诲 肃 二 惹 聘 错 锁 升 炮 怯 影 艺 式 业 曳 冷 虽 魄 酵 跑 局 搏 遗 铰 弦 0 2 = D N A 重 组
24、 技 术 = 2 0 1 3 0 2 = D N A 重 组 技 术 = 2 0 1 3 西南大学 四、其它工具酶 1. T4 polynucleotide kinase 2. Phosphatase Bacterial Alkaline Phosphatase Calf Intestine Alkaline Phosphatase 3. Terminal Deoxynucleotidyl transferase 4. 甲基化酶 5. RNase H 6. RNase A 7. S1 nuclease 8. DNA松弛酶(拓扑异构酶) 程 架 瓦 江 岩 即 想 簿 谎 入 甫 睹 媚 寓 一
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