氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞.docx
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1、氯化钙法制备感受态细胞下面的方案是Clhen 等( 1972 )所用方法的变通方案,常用于成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克螺旋质粒产生5x106-2x10 7 个转化菌落, 这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70 ,但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。)从于 37培养 16-20 小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径mm),转到一个含有100mlLB 或 SOB培养基的1L 烧瓶中。于37剧烈振摇培养约小时(旋转摇床,300 转 / 分)。为得到有效转化,活细胞数不应
2、超过108 细胞 /ml ,可每隔 20-30 分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间,600 值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大,因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的600 值,并将各浓度的增减物铺于无抗生素的琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数,从而使分光光度读数得到标化。)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml 聚丙烯管中,在冰上放置 10 分钟,使培养物冷却至。切记:下述所有步骤均需无菌操作。)于以4000 转 / 分离心 10 分钟,以回收细胞。)倒出培养液,将管倒置分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。)以
3、 10ml 用冰预冷的0.1mol/LCaCl2 重悬每份沉淀, 放置于冰浴上。 我们发现将mol/L CaCl2贮存液 用纯水( ille-Q级或与其相当的级别)配制 以 10ml 小份贮存于 -20 煞是方便。制备感受态细胞时,取一小份融化,用纯水稀释至100ml,用 Nalgene 滤器( 0.45 m 孔径)过滤除菌,然后骤冷到即可。对于大多数大肠肝菌菌株(除1061 外),在这一步采用TFB 代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。)于以4000 转 / 分离心 10 分钟,以回收细胞。)倒出培养液,将管倒置分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。)每 50ml 初始培养物用2ml 用冰预冷的
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