碱性磷酸酶的分离提取.ppt
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1、实验 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定,目的要求: 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活测定的方法,1.原理,碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。,在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活,为了获得较好的分离提取效果,在工作中特别注意以下几点: 取用新鲜的材料,提取工作应在获得材料后立刻开始,否
2、则应在低温下保存。选择来源丰富,酶含量高的材料。 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大(20,每升可溶760克),并且对许多酶没有很大的影响,因此它是最常用的盐。 在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大,提纯步骤才有效。,酶活力的分析:通常是以对-硝基苯磷酸二钠(pNPP)为底物,在pH10.1的碳酸盐缓冲液(含2 mmol/L Mg2+)的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚(pNP)的量。产物pNP在405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD405 nm 值的增加计算酶活力的大小。 酶活力定义为:在37下,以
3、2 mmol/L pNPP为底物,在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。 蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenol reagent)显色法,2操作方法 2.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 每组称取20 g牡蛎(蒸馏水洗净),加入50 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 7.5,含0.1 mol/L NaCl),(两组一起)于高速组织捣粹机匀浆1 min,于冰箱4放置1 h进行抽提。 室温离心,4000 r/
4、m 20 min,收集离心上清液,(两组分开)并量体积。(留2 mL上清液,待测酶的比活力。) 在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度(100 mL加入20.9 g)。缓慢加入,不断搅拌溶解,置冰箱静置0.5 h。 室温离心,4000 r/m 20 min,收集离心上清液,并量体积。(留2 mL上清液,对0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液pH 7.5含0.1 mol/L NaCl 透析平衡,待测酶的比活力。(不做),(5) 0.35饱和硫酸铵上清液,加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度(100 mL加入23.8 g)。缓慢加入,不断搅拌溶解,置冰箱静置2 h。 (6
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